（有机化学专业论文）不对称芳香脲的合成及其生物活性的研究.pdf

中文摘要 不对称取代脲是一类极为有用的重要精细化学品和化工原料，可广泛用做除草 剂、杀虫剂、植物生长调节荆及药物中闻体。由于结构中含有不同取代的肽键 ( - c o - n h - ) , 故大多具有生物活性。且不对称脲单元是许多酶抑制剂和生物模拟肽 的常见结构特征合成不对称取代脲的传统方法是采用光气或基于光气的异氰酸酯 法。由于异氰酸酯不稳定，不便于储存，而且要用剧毒的光气，生产极不安全。因此， 研究非光气工艺合成脲类化合物具有重要意义 本文作者利用杂环取代胺与碳酸二苯酯的反应，得到含有芳香杂环的碳酸苯酯 中间体，具有不同取代基的胺与碳酸苯酯中间体，在微波的条件下进行亲核取代反 应。合成不对称取代芳香杂环脲类化合物通过实验发现微波辐射对这类反应具有 很高的促进作用在常规回流条件下需1 2 - 2 0h 才能完成的反应，在微波辐射下， 1 5 - 3 0r a i n 即可完成，而且产率有所提高。该方法具有显著缩短反应时间，产率高、 操作简便、副产物少、易纯化等特点，是合成不对称腮类化合物的一条新途径。利 用上述方法，合成出了未见报道的2 4 个含苯并噻唑类脲类化合物( i ) ，5 0 个含有噻 二唑环的脲类化合物( ) ，( m ) 及2 2 个毗啶并噻唑类化合物( ) 采用元素分析，核 磁共振氢谱及e s i - m s 质谱对目标化合物进行结构表征，并对其合成方法进行了探 讨。目标化合物( i ) ，( ) ( ) ，( ) 的结构通式如下； 拉卜洲卜 ( i ) 妇o y h ( ) 萨。尉豇 。n 咖 ( )( ) 初步生物活性测试数据表明：部分噻唑类化合物具有一定的植物生长调节活 性，部分含1 ，3 ，牟噻二唑脲类化合物具有一定的杀菌活性，部分毗啶并噻唑脲类化 合物具有一定的杀菌活性和较好的植物生长调节活性。此外，还讨论了部分目标化 合物的构效关系 关键词：苯并噻唑獗；l ，3 。4 - 噻二瞳脲：毗啶并噻瞳脲；微波；有机合成；生物活性 a b s t r a c t u n s y m m e t r i c a lu r e 嬲a r ev e r y 璐e 如lf i n ec h e m i c a l s t h e ya r ew i d e l yu s e da s h e r b i c i d e s ，p e s t i c i d e s ，p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sa n dm e d i c i n a li n t e r m e d i a t e s h o w e v e r , t h es y a t h c t i c p r o t o c o l so fl a c a sg e n e r a l l y u t i l i z e p h o s g e n e o r p h o s g e n e - b a s e di s o c y a n a t e sa ss t a r t i n gm a t e r i a l s ，b o 出o fw h i c ha r ct o x i co ru n s t a b l e t h e r e f o r e , i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o p8 0 m ep h o s g e n e f r e er o u t e sf o ru n s y m m e t r i c a ll h e a s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s er e a c t i o n sp r o c e e d e de f f i c i e n t l yu n d e rr e a c t i o n c o n d i t i o n , s t u d i e d t h ea l lm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nr e a c t i o n sc a l lb ec o m p l e t e dw i t h i na f e wm i n u t e si nas a t i s f a c t o r yy i e l d i nc o n t r a s t , t h es a m er e a c t i o n sr e q u i r e ds e v e r a lh o u m 缸l o w e ry i e l db yt r a d i t i o n a lh e a t i n gm e t h o d t h em a i na d v a n t a g e so f m i c r o w a v em e t h o d 撕r a p i dr e a c t i o nr a t e ，h i g hy i e l d , l e s sb y - p r o d u c t s ，a n dc o n v e n i e n tm a n i p u l a t i o n t w e n t yf o u rb e n z o t h i a z o l eu r e a s ( i ) w o r es y n t h e s i z e df r o mh e t e r o c y c l i ca m i n o c o m p o u n d sa n dp h e n y l4 - c h l o r o b e n z o d t h i a z o l - 2 y l c a r b e m a t c ；丘f 哆l ，3 ，4 - t h i a d i a z o l c 懒d e r i v a t i v e s ( ，) w e r es y n t h e s i z e df r o mh e t e r o c y c l i c 锄i c o m p o u n d s p h e n y l - 5 - ( p y r i d i n e - 3 y i ) - t ，3 。4 - t h i a d i a z o b 2 y l c a r b a m a t eo r p h e n y l - 5 - ( t r i f l u o r o - m e t h y l ) - 1 ，3 ，4 - t h i a d i a z o l - 2 - y l e a r b a m a t c t w e n t yt w op y r i d y l t h i o m e ad e r i v a t i v e s ( ) w e s y n t h e s i z e df r o mh e t e r o c y c l i ca r l t i n oa n dp h e n y lt h i a z o l o 5 ，4 - b p y r i d i n - 2 y l c a r b a m a t c t h es t r u c t u r e so f t h ec o m p o u n d sw c r oc h a r a 成o r i g e db ye l e m e n t a la n a l y s e s ，i hn m ra n d e s i - m s t h es t r u c t u r a lf o r m u l a so f t h et i t l ec o m p o u n d sa r ea sf o l l o w sr e s p e c t i v e l y ： ( i )( ) n h g 想一0 一， 取 点腑 ( )( ) = o珞 n 沁a 扛 p r e l i m i n a r yb i o a s s a ys h o w st h a ts o m et h i a z o l e sd i s p l a ym o d e r a t ep l a n tg r o w t h r c g ：i l l a t o r ya c t i v i t i e s ；s o m e1 ，3 ，4 - t h i a d i a z o l el l r 豫d e r i v a l i v e sd i s p l a ym o d e r a t e f u n g i c i d a la c t i v i t i e s ；s o m ep y r i d y l t h i o u r e ad e r i v a 虹v 嚣s h o wm o d e r a t ea n t i f u n g a la n d g o o dp l a n t 霉o w l hr e g u l a t o r ya c t i v i t i e s i na d d i t i o n a l , t h es t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p s o f t h et a r g e tc o m p o u n d sw e l ed i s c u s s e d k e yw o r d s ：b e n z o t h i a z o l eu r e a s ；1 ，3 ，4 - t h i a d i a z o l ei t r e ad c r i v a t i v 龉；p y r i d y l t h i o u r e a d e r i v a t i v e s ；m i c r o w a v e ；o r g a n i cs 叫l 髓i s ；b i o l o g i c a la c t i v i t i e s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究 工作所取得的研究成果除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担 作者签名：摹元显 日期：j 7 年月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库 ，并通过网络向社会公众提供信息服务 作者签名：冬乞童 日期：矽呷年6 月p 日 导师签名： 日期：秒 日 本人已经认真阅读。c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益圄意途塞握銮卮澄唇! 旦圭生i 巨= 生旦三生筮查： 作者签名：季尧盔 日期：硼年in 8 日 第一章文献综述与课题提出 1 1 前言 不对称取代脲是一类极为有用的重要精细化学品和化工原料，可广泛用做除草 剂、杀虫剂、植物生长调节剂及药物中间体【1 】由于结构中含有不同取代的肽键 ( - c o - 誊t h - ) , 放大多具有生物活性，且不对称脲单元是许多酶抑制剂【2 】和生物模拟 驮f 3 】的常见结构特征。某些不对称取代脲还可作为石油、烃类燃料以及聚合物的添 加剂，如抗氧剂、抗沉淀剂、缓蚀剂等【4 1 ，有些含芳基及杂环基的取代脲具有高的 细胞分裂素活性已见报道【5 】例如，化合物1 作为植物的脱叶剂，用量仅为o 5 k g h a 就可以达到9 4 4 的脱叶效果；化合物2 用作化妆品和清洗材料中的杀菌剂： 化合物3 能够抑制油菜幼苗胚根的生长；化合物4 能控制水生杂草【6 】的生长还有 一些脲类化合物在医药上用作抗肿瘤试剂【7 】，用来治疗动脉硬化和高血脂【8 】，抑制 胆固醇乙酰转移酶的活性等【9 】。在照像中用氮基脲处理过的胶卷，呈像逼真，轮廓 清晰 i 0 1 ，在其他方面，氨基脲作为颜料抑制剂抑制某些生色试验中的颜色生成 h i 除去水中的氧，使钢、铁在水中不易教氧化【1 2 】，去保护木材用的木材表面的福尔马 林；用其保鲜鲜花、蔬菜和水果能保存数天不变；其处理过的皮革经久耐用；还能 用作防火剂等。目前，化学和医药工作者正在对它们进行深入地研究和开发，期望 获得更高、更广泛的生物活性的先导化合物 x b 呲。n 矗r 讫合物2 武 多”- - n h c o n d af 3 c 文s代沪a 化台物4 化合物3 1 1 1 作为腺苷调节剂的2 氨基苯并噻唑脲 目前，由于杂环化合物具有广泛的生物活性，加之其低毒、高效、对环境友好、 结构变化多样等特点，已经成为当今农药开发的热点。在杂环化合物中，最近出现 的具有极高生物活性的稠杂环化合物品种已受到极大的重视。苯并噻唑及其衍生物 作为稠杂环体系中的一员，是一类具有广泛生物活性的物质。在农用方面，具有抗 农用真菌、杀虫、杀螨、零线虫、抗植物病毒、除草、植物生长调节等活性；妇1 9 8 7 卧 1 j一艿 叫 砉妻 呦卜懒 、 霉 年德国拜耳开发的高效除草剂苯噻草胺，在浓度6 6 6 1 0 6 7m g ( 丑i ) m 2 时，对 稻田稗草及稻田一年生杂草如牛毛毡、瓜皮革、泽泻、眼子菜、水莎草等都有良好 的防效，并对水稻具有优异的选择性。另外，在医药方面。苯并噻唑及其衍生物具有 消炎镇痛、抗肿瘤、抗镓厥、治疗艾滋病、自血病以及心脑血管疾病等活性。 从人们发现并分离出具有促进植物细胞分裂活性的嘌呤类植物细胞激动素。如 激动素k t k i n e t i n 6 - ( 2 呋喃甲基氨基) 嘌呤】 1 3 】、玉米素【1 4 】和脲类细胞激动素，如 二苯脲p p u ) 【1 5 。1 6 后，人工合成的化学结构类似物相继出现，如6 苄基氨基嘌岭 ( 6 b a ) ，4 - 苄氨基苯并咪唑、二苯服衍生物【1 7 】和n 苯基n - ( 1 ，2 ，3 - 噻二唑5 基) 脲 ( t d z ) 1 s 以及苯并噻唑腺类( 其取代脲基连结在苯并噻唑的2 - 位上) 【1 9 】，并在农作 物增产优质中起了重要作用取代脲类化合物由于结构中存在不同取代的酰胺键。 大多具有较好的生物活性【2 0 1 ，常用作植物生长调节裁、除草剂、杀菌帮等。特掰 是对苯并噻唑腮类化合物及噻二唑脲类化合物，目前仍旧是研究的热点。 瑞士的弗哈夫曼拉罗切有限公司【c n l 6 0 2 1 9 6 】通过对2 氨基苯并噻唑脲的研 究，发现2 - 氨基苯并噻唑脲( 化合物i ) 及其可药用酸加成盐在制备用于治疗与腺苷 a 2 受体系统相关的疾病的药物中的用途这类疾病包括阿尔茨海默氏病。帕金森氏 病，亨廷顿舞蹈病，神经保护，精神分裂症，焦虑，疼痛，呼吸低下，抑郁，药物成 瘾如苯丙胺，可卡因，阿片类药物，酒精。烟碱，大麻素成瘾，或哮喘，过敏性反应。 缺氧，局部缺血，发作和精神活性物质澄用此外，这类物质还可用作镇定剂，肌肉 松弛剂，抗精神病药，抗癫痫病药和用于疾病如冠状动脉疾病和心力衰竭的心脏保 护剂。 r 甲n 、o r 1 l l 人广n h - c _ n ：r 2 t 口 n d 化合物i 腺苷通过与特异性细胞表面受体相互作用而调节众多生理机能。腺苷受体作为 药物靶的潜能首次于1 9 8 2 年受到评论。腺苷在结构上和代谢上都涉及生物活性核 苷酸腺昔三磷酸a t p ) ，腺苷二磷酸( a d p ) ，腺菅一磷酸( a m p ) 和环状腺苷一磷酸 ( c a m p ) ；涉及生化甲基化剂s 腺苷基l 甲硫氨酸( s a m ) 并在结构上涉及辅酶 n a d ，f a d 和辅酶并涉及r n a 。腺苷和这些相关化合物在调节细胞代谢的许多 方面和调节不同的中枢神经系统中均是重要的。 2 腺昔的受体已被划分成a l ，a 2 a a 2 b 和舢受体，它们属于g 蛋白偶联的受体家 族。腺苷受体经腺苷活化可启动信号传导机制。这些机制取决于与受体相关联的g 蛋白各腺苷受体亚型经典的特征在于腺苷酸环化酶效应器系统该系统利用 c a m p 作为第二信使。与g l 蛋白偶联的a l 和a 3 受体抑制腺苷酸环化酶。导致细胞 蝴水平降低，而a 2 a 和a 2 b 受体与岛蛋白偶联并激活腺苷酸环化酶，导致细胞 c a m p 水平升高已知a 1 受体系统包括活化磷脂酶c 和调节钾离子和钙离子通道 山亚型除了与腺苷酸环化酶相关之外，还可以刺激磷脂酶c 并由此激活钙离子通 道 a l 受体( 3 2 6 - 3 2 8 个氨基酸) 自各种属( 犬，人，大鼠。狗，鸡，牛，豚鼠) 克隆，哺 乳动物种属中的序列同一性为9 0 - 9 5 a 2 a 受体( 4 0 9 4 1 2 个氨基酸) 自犬，大鼠，人 豚鼠和小鼠克隆。a 2 b 受t 敏3 3 2 个氪萋酸) 由人和小鬣克隆，入a 2 b 与人a 1 和a 2 a 受体具有4 5 同源性。a 3 受体( 3 1 7 3 2 0 个氨基酸) 自人，大鼠。狗，兔子和绵羊克隆 a l 和a 弧受体亚型被认为在能量供应的腺苷调节中起补充性作用。腺苷是a t p 的 代谢产物，它从细胞中扩散并局部作用以活化腺苷受体，降低需氧量( a 1 ) 或增加供 氧量( a 2 a ) ，由此恢复能量供应平衡：组织内的需要。这两种亚型的作用均是增加组 织可获得氧的量并保护细胞免受由短期氧不平航导致的损伤内源性腺苷的重要功 能之一是防止在创伤如缺氧，局部缺血，低血压和发作活动过程中的损伤。 此外，已知腺苷受体激动剂与表达大鬣a 3 受体的肥大细胞的结合导致肌酵三 磷酸和细胞内钙浓度增加，这加强了抗原诱导的炎症递质的分泌因此，a 3 受体在 介导哮喘发作和其它过敏性反应中发挥一定的作用。 腺苷是神经调节剂。能够调节大脑生理机能的许多方面内源性腺苷是能量代 谢和神经元活动之间的中枢连接，其因行为状态和( 病理) 生理条件而异在能量需 求增加和能量获取降低的条件( 如缺氧，低血糖症和，或神经元活动过度) 下，腺苷可 提供强大的保护性反馈机制。与腺苷受体相互作用代表了在许多神经系统和精神疾 病如癫痫症，睡眠疾症，运动病症 帕金森氏病或亨廷顿舞蹈病) ，阿尔茨海默氏病， 抑郁，精神分裂症或成瘾中的有希望的治疗干预目标。在创伤如缺氧，局部缺血和 发作之后，神经递质的释放增加这些神经递质最终导致神经变性和神经死亡。这 会导致脑损伤或个体死亡。模拟腺苷的中枢抑制效果的腺苷a l 激动剂因此可用作 神经保护剂腺苷已经建议作为内源性抗惊阙巍抑制从兴奋神经元中释放谷氨酸 并抑制神经元放电( 丘啦g ) 。 腺苷激动剂因此可用作抗癫痫剂。腺苷拮抗剂刺激c n s 的活性并证实是有效 的认知增强剂选择性a 2 a 拮抗刹在治疗各种形式的痴呆例如阿尔茨海致氏病以及 3 神经变性疾病例如中风中具有治疗潜力腺苷a 2 a 受体拮抗剂调节纹状体g a b a 能神经元的活性并调节平稳且协调良好的运动，因此提供对帕金森病症的潜在治 疗。腺苷还牵涉许多涉及镇静，催眠，精神分裂症，焦虑，疼痛，呼吸，抑郁和药物 成瘾( 苯丙胺，可卡因，阿片类物质，酒精，烟碱，大麻素成瘾) 的生理过程。作用于 腺苷受体的药物因此具有作为镇定剂，肌肉松弛剂，抗精神病药，抗焦虑药，镇痛 剂，呼吸兴奋剂，抗抑郁剂的治疗潜力并用于治疗药物滥用他们还可以用于治疗 a d h d ( 注意力缺陷多动症) 。 腺苷在心血管系统中的重要作用是作为心脏保护剂。内源性腺苷的水平应局部 缺血和缺氧而增加，并在刨伤期间和之后保护心脏组织( 预处理) 通过作用于a l 受 体。腺苷a i 激动剂可使得免受由心肌缺血和再灌注导致的损伤。a 2 a 受体对肾上腺 索功能的调节影响可能牵涉各张病症如嚣状动脉疾病和心力衰竭。a 2 a 拮抗物可在 需要增强抗肾上腺素功能的情形中如在急性心肌缺血的情形中具有治疗益处针对 a 2 a 受体的选择性拮抗剂也可增强腺苷在终止室上性心律失常中的效果。 腺苷可调节肾功能的许多方面，包括肾素释放，肾小球滤过率和肾血流。拮抗 腺苷对肾的影响的化合物具有作为肾保护剂的潜力此外。腺苷a 3 和戚a 2 b 拈抗 剂可用于治疗哮喘和其它过敏性反应和或治疗糖尿病和肥胖症因此，本发明作者 通过对2 - 氨基苯并噻唑脲的研究发现2 氨基苯并噻唑艨( 化合物i ) 及其可药用酸 加成盐在用于治疗与腺菅恕受体系统相关的疾病中有很好的疗效 1 i 2 作为酪氨酸激酶抑制剂的苯并噻唑衍生物 至少有4 0 0 种酶被鉴定为蛋白激酶，这些酶催化靶蛋白底物的磷酸化磷酸化 通常是将磷酸基团从a t p 转移至所述蛋自底物的反应。磷酸转移至靶蛋自底物中的 特定结构是酪氨酸，丝氨酸或苏氨酸残基。由于这些氨基酸残基是磷酰基转移的靶 结构，因而这些蛋白激酶通常被称为酪氨酸激酶或丝氨酣苏氨酸激酶。 酪氨酸，丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化反应和反向的磷酸酶反应涉及构成对 多样化胞内信号( 通常通过细胞受体介导) 应答，细胞功能的调节以及细胞过程的激 活或失活的基础的多种细胞过程蛋白激酶级联常常参与细胞信号转导。对于这些 细胞过程的实现是必不可少的。因为蛋白激酶在这些过程中普遍存在，所以可以发 现它们作为质膜的主要部分或者作为胞质酶或定位于细胞核内，通常作为酶复合体 的组成部分。在许多情况下，这些蛋白激酶是酶和结构蛋白复合物的必需成分。决 定在细胞内细胞过程在何时何地发生。 蛋白酪氨酸激酶( 阿 篷化区或激酶区，这一 区域在氨基酸组成上与其它s i c 家族成员高度同源；( 4 ) 调节区，位于羧基端，可能与 p 5 6 1 c k 的p t k 活性的特异调节有关( 图1 2 ) 。 7 l ：l 蔫磷瓤 l 黟 o f 。 。f 图1 - 2p 5 6 c k 分子的功能区 2 p 5 6 1 c k 的功能特点 p 5 6 1 c k 底物作用区存在几个位置尚不明确的s e t 磷酸化位点；催化区l y s 2 7 3 是 a t p 结合点，t y r 3 9 4 为自身磷酸化位点；调节区t y r s 0 5 是调性磷酸化位点在静止 细胞中，p 5 6 1 c k 在t y r 5 0 5 上发生磷酸化，但当细胞活化时这个残基则发生去磷酸化。 随之发生激酶的活化以及t y r 3 9 4 的自身磷酸化。目前研究认为，c d 4 5 通过使t y r s 0 5 去磷酸化对p 5 6 1 c k 起正调控作用：而p 5 0 c s k 是使t y r 5 0 5 发生磷酸化对p 5 6 1 c k 则起 负调控作用c d 4 5 和p 5 0 c s k 对其它s i c 家族阿也发挥着同样的调节作用 ( 二) p 5 6 1 c k 与c d 4 c d 8 分子 l p 5 6 1 c k 的分布 c d 4 和c d 8 以共受体形式( c o r e c e p t o r ) 表达于成熟的t 淋巴细胞，尽管c d 4 和 c d $ 跨膜分子都属于免疫球蛋白超家族，但它们之间仅存在有限的同源性。c d 4 和 c d 8 分子分别与m i - i ci i 类和m i - i c ：i 类分子的恒定区决定簇相互作用。c d 4 是分子 量为5 5 - 6 0 k d a 的糖蛋白，以单体形式表达c d g 是由二致辞体组成，有两种形式： 一种是由两条理链( 3 2 3 4 k d a ) 组成的同源二聚体；另一种形式是由口链和口链 ( 2 5 - 2 6 k d a ) 组成的异源二聚体。c d 4 和c d g 分子中胞浆内部分子不具有激酶功能区。 因此它们与受体酪氨酸激酶如e g f - r 或p d g f - r 无同源性。目前已经证实c d 4 和 c d 8 均与信号转导成份p 5 6 1 c k f f k 相连接。p 5 6 1 c k 几乎在所有淋巴细胞中表达。包 括全部成熟t 细胞和胸腺细胞。提示它可能在t 细胞活化和分化调节过程中起作 用。有关p 5 6 1 c k 在t 细胞活化信号中正调节作用的最初发现是p 5 6 1 c k 直接同c d 4 或c d 8 复合受体分子胞浆内功能域相连接，在体外具有酪氨酸激酶活性，在体内，t 细胞受到刺激后酪氨酸磷酸化水平增加。即使在静止的鼠c d 4 - - t 细胞中也有大约 5 0 细胞内p 5 6 1 c k 是同c d 4 糖蛋白相连接。 8 图i - 3p 5 6 1 c k 同c d 4 c d 8 作用的模式圈 2 p 5 6 1 c k 与c d 4 c d 8 分子的连接 p 5 6 1 c k 同c d 4 c d 8 相互作用的区域位于分子的氨基端的底物作用区f 图1 - 3 ) , 此区域在s r c 相关p 1 1 ( s 中是独特的，含有4 个半肮氮酸，这对于p 5 6 1 c k 与c d 4 和 c d 8 相互作用是必须的底物作用区中6 个带负电荷的氨基酸可使p 5 6 1 c k 与 c d 4 c d 8 结合位点内相对应的碱性氨基酸残基相结合在c d 睁耩c d g a 分子的胞 浆内有一个含1 3 个氨基酸的相似区域，经突变研究和肽竞争分析法证实此区域可 能为p 5 6 1 c k 结合区域。c d 4 和c d s a 含有两个对于p 5 6 1 c k 结合起关键作用的半肮 氨酸以及与p 5 6 1 c k 氨基末端负电荷相互作用的5 个带正电荷的氨基酸证实此区域 中有6 个氨基酸直接与p 5 6 1 c k 结合有关，如果把这6 个氨基酸残基从c d s a 胞浆功 能域转移到一个非相关蛋白水泡性口炎病毒糖蛋白( v s v - g ) 胞浆功能区域上，p 5 6 1 c k 即可结合到这个杂交分子上去 3 p 5 6 1 c k 参与t 细胞活化 用蛋白激酶c 激活剂刺激t 淋巴细胞可引起p 5 6 1 c k 从c d 4 分子上解离下来。随 后发生c d 4 内化。c d $ 分子在这方面不同于c d 4 ，c d s + t 淋巴细胞经p k c 激活嗣 刺激事对c d $ 分子内化以及c d s - p 5 6 1 c k 的解离影响极微现已提示，p 5 6 1 c k 可能以 生长因子p t k 受体相同方式起作用，即t c r 结合与m h c 相连的抗原后。c d 4 中 c d 8 与m h c 相互作用，与c d 4 或c d 8 相连接的p 5 6 1 c k 补充到t c r 多肽胞浆内部 9 分靠得很近的区域。然后发生p t k 的活化以及t c r 内底物和或其邻近分子的磷酸 化p 5 6 1 c k 除参与抗原诱导的淋巴细胞活化外，还可能参与t 细胞的分化和成熟。 在t 细胞分化的所有阶段，包括c d 4 、c d 8 双阳性胸腺细胞都可检测到p 5 6 1 c k 与 c d 4 和c d 8 形成的复合物。 ( 三) p 5 6 1 e k 与非c d 4 c d 8 分子 p 5 6 1 c k 除了同c i m 和c d 8 形成复合体外，还可能同另外一些参与信号转导的 细胞受体分子形成稳定的复合物。 1 p 5 6 1 e k 与i l - 2 r 的关系 i d 2 r 由m 卢、7 - - - 条肽链组成，三条肽的不同组合即0 0 1 , 所以及单独a 分别 构成，2 的高、中、低三种亲和力的受体由于r , - 2 r a 链在胞浆内仅有一个较短 韵功能域( 1 3 个氮基酸残基) 所以介导i l - 2 r 信号转导主要为声和_ r 链m - 2 r # 链 胞浆内有两个结构域：其中一个靠近细胞膜，富含丝氨酸，对于i l - 2 诱导的增殖信号 具有重要作用；另一结构域远离细胞膜。富含酸性氨基酸，为酪氨酸激酶物理连接 部位。经x l - 2 r # 链免疫沉淀后进行免疫印迹也证实了m - 2 k a 链同p 5 6 1 c k 相连体 外系统中也发现r , - 2 结合到i l - 2 r 后可促进p 5 6 1 e k 活性。引起m - 2 r a 链的酪氮酸 磷酸化i l - 2 r 7 链胞浆内含8 6 个氨基酸，无激酶功能区，但具有一个与s h - 2 同源 的区域，可能参与i l - 2 r 介导的信号转导最近研究表明，i l - 2 r 7 链为皿一4 、i l - 7 、 i l - 9 、，1 3 等细胞因子受俸所共用( c o m m o nc h a j | n 1 c ) 2 p 5 6 1 e k 与其它分子的关系 同p 5 6 1 e k 相互作用的其它一组分子有人t 细胞糖磷脂酰肌醇 ( g l y c o p h o s p h a t i d y f i n o s r o l , g p i ) 连接的蛋白包括c d 5 9 、c d 5 5 、c d 4 8 以及小鼠t 细 胞中的t h y - i 应用免疫沉淀方法均能使这些分子同p 5 6 1 e k 发生共免疫沉淀。此外， 将t 淋巴细胞同针对g p i 连接的膜分子特异性抗体孵育，然后加入二抗使其交联， 均发生几种内源性底物的酪氨酸磷酸化。 许多g p i 连接的细胞表面分子可能以两种不同的形式表达在t 细胞中：这是由 相应分子m r n a 不同拼接所致。一种形式是通过g p i 附着在细胞膜上，另一种形式 具有跨膜区和胞浆的p l c 去掉所有g p i 相连的膜蛋白后进行免疫沉淀，并分析它们 相连的激酶活性。发现大多数酪氨酸磷酸化活性已丧失，表明g p i 连接物对于同 p 5 6 1 e k 相结合是必需的。 采用烷基化试剂或金属离子结合试剂迸一步证实了c d 4 c d 8 多肽和g p i 连接 膜蛋白是分别通过两种不同的机理与p 5 6 1 e k 相互作用的。这些试剂可以干扰p 5 6 1 e k 同c d 4 或c d 8 分子的相互作用，因为p 5 6 1 e k 同c d 4 或c d 8 的相互作用依赖游离 1 0 半胱氨酸的存在，并需要金属离子使之稳定这种结合；而p 5 6 1 c k 与g p i 相连结的蛋 白的结合则不受这些试剂影响这些结果表明。p 5 6 1 c k 通过两种或更多不同相互作 用机理，直接或间接地同多种细胞表面蛋白形成复合物。 二、p 5 9 f y n 1 p 5 9 f y n 的分布和结构 p 5 9 f y n 为非受体p t k s 哦家庭的一个成员，见于多种细胞中。由于基因拼接的 差异产生了两种不同形式的p 5 9 f y n 。一种以高水平表达于大脑中( p 5 9 f = y n b ) 另一种 主要存在于t 淋巴细胞( p 5 6 f y n t ) p 5 9 f y n 基本结构类似于p 5 6 1 c k 和p 6 0 s r c 它 通过氨基末端豆蔻酸的基团共价结合于胞浆膜内面，羧基末端有一个负调控功能域， 包括含有一个酪氨酸磷酸化位点z y r 5 2 8 。与p 5 6 1 c k i 、r s 0 5 和p 6 0 s r c t y r 5 2 7 所起的功 能相似此外，p 5 9 f y n 还有一个自身磷酸化位点t y r 4 1 7 2 p 5 9 f y n 的功能 p 5 9 f y n 可能与t 细胞活化调节有关的证据最初来自对带有耻0 y m p h o - p r o l i f e r a t i o n ) 或g l d ( g e n e n t i z e dl y m p h o p r o l i f e r a f i v ed i s e a s e ) 常染色体隐性基因小鼠t 淋巴细胞特性的研究。这些t 细胞可以表达高于正常t 细胞l o 倍的p 5 9 f y i l 活性 由于大量不成熟t 细胞扩增，聃和g l d 纯合予小鼠可发生严重的淋巴结病和自身免 疫性疾病。迸一步研究发现，这些t 细胞存在着固有的酪氨酸磷酸化的t c r - i 链， 并提示f 链磷酸化可能是由p 5 9 f y n 所介导的1 p r 小鼠的t 细胞不能经t c r c d 3 途径对刺激剂产生应答，可能是由于f 链内在的磷酸化而使t c r 与p l c y l 脱偶联有 关。p 5 9 f 啪同t c r c d 3 复合物相连结。用温和去垢剂抽取细胞膜后与抗3 f 体一 起孵育时，p 5 9 句n 可与c d 3 组份发生共免疫沉淀。上述所有推测表明。p 5 9 f y n 是t c r 连接的信号转导结构所必需的，与p 5 9 驷相连t c r c d 3 亚单位是c d 3 e 不成熟 c d 4 + c d s + 胸腺细胞中p 5 9 f y n 表达水平相对较低。当分化为c 1 m + c d 8 - 或 c d 4 - c d 8 + 成熟t 细胞时，p 5 9 f y n 表达水平增加了1 0 倍。表明p 5 9 f y n 有利于t 细胞 的分化用f y n c d n a 同l c k 启动子融合后建立的转基因小鼠，p 5 9 f y n 表达水平升高 约2 0 倍，并对t 细胞系具有严格的限制性。虽然转基因小鼠胸腺细胞表型类似于正 常鼠胸腺细胞，但对t c r 介导的刺激应答增强，同时伴有酪氨酸磷酸化、细胞的钙 离子浓度、i l - 2 产生和细胞增殖水平均明显升高 三、s h 2 结构域的调节作用 ( - - ) s h - 2 结构域的结构特点 前已所述。阿矗中的s r c 家族包括p 5 6 1 c k 和p 5 9 f y n , 这两个分子的氨基端有三 个同源的区域。其中一区域对于豆蔻酸的附着是必需韵，豆蔻酸可以通过琉水的稆 互作用和或同一种胞浆膜蛋白结合的方式使得激酶定位于质膜上，这种胞浆膜结 合蛋白实际上是豆蔻酸化多肽特异性受体。第二区域称为s i c 同源区3 ( s r ch o m o l o g y 3 ，s h 3 ) ，为一个保守的氨基酸序列，约含s o 个氨基酸，可见于多种胞浆信号蛋白 伍驴a l i n g p r o t e i n ) 以及肌动蛋白结合蛋白中，如肌球蛋白、血影蛋白以及酵母细胞骨 架蛋白。目前研究发现s h - 3 识别的部位是一些富含脯氨酸的区域。但对于s h 3 结 构域的功能研究还不太清楚，可能与以下几种功能有关：( 1 ) 在信号转导过程中调 节蛋白与蛋白之间相互作用；( 2 ) 调节s f c 相关p t k s 与细胞骨架中某些成份相互 作用；( 3 ) 连接酪氨酸激酶途径与小g 蛋白( s m a l lgp r o t e i n ) 所调控的途径。第三区 域称为s m 同源区2 ( s r ch o m o l o g y2 ，s h - 2 ) , 能够识别蛋白中磷酸化的酪氨酸残基， 是一个保守的蛋白序列。约有1 0 0 氨基酸残基组成。通过x 光衍射晶体分析法发现 s h - 2 的中心为反平行母片层结构。为s h - 2 同磷酸化酪氨酸残基作用部位，两俩为口 螺旋结构s h - 2 主要存在于多种胞浆信号蛋白中( 见图1 4 ) ，如p i p 2 特异的p l c 、 磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p b a t i d y l i n o s i t o | 3k i i l a p i - 3 k ) 的调节亚单位 8 5 ) ，调节m 活性的r a s - g t p 酶激活蛋白( g r p a a c t i v a t i n gp r o t e i n , 6 船) 以及c r k 、a b l 和v a v 原 癌基因产物等 渊泓蹇垦j 菱趋 咖撕】冒j 蚤i 至0 锄滞j 重耋= ，t 星! 丑 黼懈= 重量 二互歪二 ，瓣嘲睁喜氍= = = 亡= = 一 蝴4 = = = = 二童喜宦 霸曜粕蛾臻l 窜喝，鞠镶譬富l 图l - 4 参与t 细胞活化并含s h 2 、s h 3 结构域分子的模式图 ( - - ) s h 一2 结构域的功能 s h - 2 的主要功能是介导胞浆内多种信号蛋白的相互连接，形成蛋白异聚体复 合物，从而调节信号转导途径中的信号传递。信号蛋白的相互连接是通过在一个多 肽分子上s h - 2 结构域与另一分子磷酸化的酪氨酸残基直接相互作用而完成的，并 通过酪氨酸残基的磷酸化或去磷酸化而褥到调控。胞浆内信号蛋白分子中s h - 2 作 为一种具有识别功能的结构可以同具有阿【活性的细胞因子受体或珊【相关分子 相结合( 图1 - 5 ) 如小鼠血小板衍生的生长因子受体3 ( p d g f - ! r ) 本身具有酪氨酸激 酶活性，当与配体p d g f 结合后，受体本身可以发生二聚体化( d i m e r a t i o n ) 。形成二 聚体的两条链互相交叉催化导致受体自身酪氨酸磷酸化某特定位点的磷酸化的酪 氨酸可以同胞浆内某些信号蛋白中的s h - 2 结合。使得具有p t k 活性的激酶接近信 号蛋白，然后使信号蛋白发生酪氨酸磷酸化，从而启动多种信号转导途径。例如 ( 1 ) p l c 中7 亚单位发生酪氮酸磷酸化后激活p l c , 水解p i p 2 产生d a g 和妒3 第二 信使物质。进一步发挥詹号转导作用；( 2 ) g a p 的激活可以提高g t p 酶活性；o ) p i - 3 k 中的酪氦酸残基磷酸化后即被激活。提高p i - 3 k 产物水平 p t d l n s 3 p 、p t d l n s ( 3 、4 ) p 2 、 p t d i n s ( 3 、4 、5 ) p 3 3 。进而在信号转导过程中发挥重要作用 图l - 5 胞浆内信号蛋白通过其s h - 2 与生长因子受体中磷酸化的酪氨酸残基相互作用模式图 此外，p t k 上的s h _ 2 结构域能够与磷酸酪氨酸残基直接相互作用，由此提供 一种酶活性的开关控制作用。根据这个模塑，p 5 6 1 c k 在静止的t 细胞中无活性状态 是由于磷酸化的t y r 5 0 5 和s h - 2 氨基末端结构域之间的相互作用这种相互作用需 要分子的折叠造成构象的改变，从而掩盖了激酶功能域，阻断了酶的活性。 ( 三) v 甜蛋白 v a v 癌基因产物是t 细胞活化过程中另一种含s h - 2 蛋白。v a v 蛋白含个s h 2 和两个s h - 3 结构以及其它一些常见于转录因子中的结构，包括一个碱性区域螺旋 环- 螺旋亮氨酸拉链结构域。可使蛋白形成二聚体并具有d n a 结合活性的锌指结构 以及个核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ) 。t c r 发生交联后的t 细胞以及经 e g f - r 、p d g f - r 、i g e - r 以及i r 她- r 刺激途径的其它细胞类型如成纤维细胞、嗜碱 性粒细胞、b 淋巴细胞均有v a v 蛋白酪氨酸磷酸化的发生v a v 酪氨酸磷酸化可能 使v a v 从膜附着的受体复合物中释放出来并进入细胞核内，通过直接结合到d n a 上调节基因的转录。因此v a v 代表了一个独特的酪氨酸磷酸化底物，它可以通过把 细胞表面受体与转录调控连接起来的方式，在信号转导中发挥独特的作用 到目前为止，临床上使用的大多数抗癌药物为细胞毒制剂。这类药物有着不可 避免的缺点，如低选择性、毒副作用强和易产生抗药性等近年来，随着生命科学 研究的飞速进展。恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的谲控、细胞凋亡的诱导、 血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等基本过程正在被逐步阐明以一些与肿 瘤细胞分化增殖握关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性 作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研 究开发的重要方向。f r k s 在信号转导中起关键作用，同时又调节细胞的增殖、分化、 凋亡，并参与其他各种调节机制过去一些年来，有3 0 多种p t i c s 抑制剂或抗体处 在临床研究的不同阶段，有的已经上市，包括h e r c e p t i n ( t m s m z u m a b ) 、 g l i v e c ( s t l 5 7 1 ，i m a t i n i b ) 、h 吲；a ( z d l 8 3 9 ) 、t a r c e v a 和a v a n i n , 并取得了令人鼓舞的 德国的k e v i ne c u s a c k 等人2 0 0 3 年在其专利u s 2 0 0 3 0 1 5 3 5 6 8 中描述了苯并噻 唑脲衍生物( 化合物i i ) 可以作为酪氨酸激酶抑制剂，特别是癌症和血管生成过程中 重要的酪氨酸激酶的抑制剂 磁 芬 掣d 化合物l i 例如，在系列化合物i i 中，某些化合物是诸如k d r , f i t - 1 ，v e g f r - 3 ，f g f r , p d g f r , c m e t 面越，t i e - l ，或i g f - i - r 的受体激酶的抑制剂。由于这些化合物中的 某些化合物抗血管生成，因面它们是用于抑制其中血管生成是重要主分的病症( 例 如癌症，关节炎和眼心血管形成) 过程的重要物质。某些化合物可有效作为诸如 p k c s ，e 1 1 【m a p 激酶，c a t k s ，p l k - 1 或r a f - i 的丝氨酸苏氨酸激酶的抑制剂。这些化合 物可用于治疗癌症和高增生性疾病。另外。某些化合物是非受体激酶例如s r c ( 例如 i c l c b l k 和l y n ) ，t e c ，c s k , j a k ，m a p ，n i k 和s y k 家族的那些激酶的有效抑制剂。这些 1 4 化合物可用于治疗