（微生物学专业论文）藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究.pdf

南京师范大学倾士学位论文藻菌复台固定化祛除微囊藻毒索的研究 摘要 有毒蓝藻产生的蓝藻毒素导致地表水的污染已是全球普遍的现象，最常见的 毒素是能导致肝癌的肝毒素微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，m c ) ，m c 在水中有很高的 化学稳定性，传统净水工艺不能有效去除。许多研究在探索m c 祛除的方法，利 用微生物降解m c 是一条有效的途径。 在实验室大量培养铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sp c c7 8 0 6 ) ，用7 0 的甲醇提取 m c ，然后用c 1 8 固相萃取小柱分离纯化。通过h p l c 分析测定，获得的提取物中 微囊藻毒素两个主要种类m c r r 和m c l r 的含量分别为9 3 和6 8 r 2 左右，主要 为m c l r ，该毒素混合物在本研究中作为筛选降解菌的底物。 从发生过蓝藻水华的水体中分离获得能显著降解m c 的细菌1 8 株，在给定的 条件下相对降解率从1 8 4 到4 8 2 。对其中降解能力较高的菌株s 3 进行了深入 研究。在起始浓度m c l r 约为5 0 r n g l 、接种浓度0 d 6 5 0 约为0 3 5 0 的情况下，7 2 h 后s 3 降解率达n 7 8 3 1 。温度、p h 对菌株s 3 n 生k 状况和降解能力有较大的影 响。菌株s 3 生长和降解效率的最适温度为3 0 ，最适p h 为7 。 利用海藻酸钠将降解菌s 3 和椭圆小球藻进行混合共【直l 定化。一方面，提高了 固定化椭圆小球藻的生长速度。另一方面，共固定化藻菌体系比单一固定化菌对 m c 有更佳的去除效果。固定化细胞的降解能力受温度和p h 的影响较小，温度在 2 0 3 7 。c 、p h 在5 9 范围内，降解率能达n 6 0 以上。固定化细胞经过重复使用后， 对m c l r 仍具有很高的降解活性。 通过形态特征、生理生化特征以及1 6 s r d n a 序列分析，初步确定s 3 菌株 属于类芽孢杆菌属( p a e n i b a c i l l u s ) 。 关键词：水华；微囊藻毒素；细菌降解；固定化：椭圆小球藻 南京师范大学硕士学位论文 藻苗复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 a b s t r a c t c y a n o t o x i n sp r o d u c e db yc y a n o b a c t e r i ah a v ec a u s e dp o l l u t i o n si nl a n ds u r f a c e w a t e ra r o u n dw o r l d t h em o s tc o m m o nt o x i ni sm i c r o c y s t i n ( m c ) ，ac a n c e ri n d u c i n g h e p a t o x i n m ci sc h e m i c a l l ys t a b l ei nw a t e ra n dc a n l tb ee f f e c t i v e l yr e m o v e db y c o n v e n t i o n a lw a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s m i c r o b i o l o g i c a l d e g r a d a t i o ns h o u l db e a s u i t a b l ew a y i nt h i ss t u d y , w eu s e db g - 11m e d i u mt oc u l t u r em i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a p c c 7 8 0 6i nt h el i b r a r y m cw a se x t r a c t e db y7 0 m e t h a n o l ，t h e nc o n c e n t r a t e da n d p u r i f i e db yc j ss o l i d - p h a s ee x t r a c t i o nc o l l u r n t h er e l a t i v ec o n t e n t so fm c l rm a d m c r ri nt h ee x t r a c tw e r e6 8 2 a n d9 3 ，r e s p e c t i v e l y , o nt h eb a s i so fh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n a l y s i s m c l rw a sad o m i n a n tt y p e o fm c w eu s e dt h i sm ce x t r a c ta ss e l e c t i v es u b s t r a t et oi s o l a t em cd e g r a d a b l e b a c t e r i a f r o mc y a n o b a c t e r i a lb l o o mf o r m i n gw a t e rb o d ys u c ha sx u a n w ul a k e ，q i n h u a i r e v e r ，w eg o te i g h t e e nb a c t e r i a ls t r a i n s ，w h i c hc o u l dd e g r a d em c - l ro b v i o u s l y t h e r e l a t i r ee m c i e n c i e sw e r ef r o m18 4 t o4 8 2 w es t u d i e do i lt h es t r a i ns 3w h i c h h a dh i g h e s tr e l a t i v ee f f i c i e n c y w i t ht h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fm c l ra t5 0m g l a n dt h ei n o c u l t m as i z eo fo d 6 5 0a to 3 5 t h ed e g r a d i n gr a t eo fm c - l rb ys t r a i ns 3 r e a c h e d7 8 3 1 a f t e r7 2 h t h ec h a n g eo f t e m p e r a t u r ea n dp hh a dm u c hi n f l u e n c eo n t h eg r o w t hs t a t u sa n dd e g r a d i n ge f f i c i e n c yo fs t r a i ns 3 a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e o f d e g r a d i n gm c - l r i s3 0 。c ，t h eo p t i m a lp hv a l u ei s7 t h es t r a i ns 3a n dc h l o r e l l ae l l i p s o d e aw e r ec o - i m m o b i l i z e db ys o d i u ma l g i n a t e o no n es i d e ，t h ec o i m m o b i l i z e ds y s t e mi n h a n c e dt h eg r o w t hv e l o c i t yo f t h ei m m o b i - l i z e dc h l o r e l l ae l l i p s o d e a o nt h eo t h e rs i d e ，t h er e m o v ee f f i c i e n c i e so fm c l ro f c o i m m o b i l i z e da l g a ea n db a c t e r i aw e r eh i g h e rt h a nt h a to fi m m o b i l i z e db a c t e r i a t h e c h a n g eo ft e m p e r a t u r ea n dp hh a dm u c hl e s si n f l u e n c eo nt h ed e g r a d i n ge f f i c i e n c yo f i i 南京师范大学硕士学位论文 藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 i m m o b i l i z e dc e l l st h a nt h ef r e ec e l l s w h e nt h et e m p e r a t u r ev a r i e df r o m2 0 。ct o 3 7 。c ，t h ep hv a l u ew a sf r o m5t o9 ，t h ed e g r a d i n ge f f i c i e n c i e sw e r ea l la b o v e6 0 t h ei m m o b i l i z e dc e l l sw h i c hw e r eu s e da g a i n ，t h ed e g r a d i n ge f f i c i e n c i e st om c l r w e r es t i l lh i g h a c c o r d i n gt op o l y p h a s i ct a x o n o m i cm e t h o d s ，c o m p r i s e dm o r p h o l o g i c a la n d c u l t u r ec h a r a c t e r i s t i c s ，16 s r d n a a n a l y s i s ，t h es t r a i ns 3w a si d e n t i f i e dp a e n i b a c i l l u s k e yw o r d s ：c y a n o b a c t e r i a lb l o o m ；m i c r o c y s t i n ；b a c t e r i a ld e g r a d i n g ； i m m o b i l i z a t i o n ；c h l o r e l l ae l l i p s o d e a i l l 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 x9 8 0 98 8 f 、 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表 或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：亟亟碰 日 期：! 乒。f 堡 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 第一章文献综述 1 微囊藻毒素的产生、结构和毒性机理 1 1 蓝藻水华及其毒素 随着水体富营养化程度的加剧和范围的扩大，淡水蓝藻水华暴发的频率和强 度日趋严重。当蓝藻水华严重时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，散发出恶臭， 不仅大量消耗水中溶解氧，使鱼类窒息死亡；而且释放出藻毒素【1 1 危害人类和其 他生物的安全。淡水水华检测到的藻毒素主要有3 种化学结构：环肽、生物碱和 脂多糖。环肽毒素包括七肽的微囊藻毒素和五肽的球藻毒素；生物碱有神经毒性 类毒素、石房蛤毒素、类毒素“s ) 和高类毒素a 、瘫痪性贝毒素，以及细胞毒性 生物碱、皮肤毒性生物碱和刺激性毒物脂多糖( l s p ) 。微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ， m c ) 是在蓝藻水华中出现频率最高、分布广泛、毒性较大的一类藻毒素。产生 微囊藻毒素的淡水蓝藻主要有铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 、鱼腥藻 n a b a e n a ) 、颤藻( o s c i l l a t o r i a ) 和念珠藻( n o s t o c ) 嘲。m c 是细胞内毒素，它在细 胞内合成，当藻细胞破裂后被释放出来并表现出毒性。 1 2 微囊藻毒素的产生 现已从铜绿微囊藻染色体中分离出了产生m c 的d n a 片断m c y ，发现凡是能 够产生藻毒素的藻种都含有m 钞基因，藻毒素的合成由它们控制，并由肽合成酶 复合体催化合成，但不产生藻毒素的藻种有的也含有m c y 基因【3 ”，这说明环境因 子的改变可以调节和控制基因的表达。有研究表明藻毒素是初级代谢产物 5 , 6 1 ， 其主要作用是通过鳌合使进入藻体内的重金属离子减轻毒性【7 1 和抑制其它水生 植物并促进其本身的生长【8 】。 影响m c 合成的环境因子较多，主要的有光照、温度、p h 值和营养元素。相 对来说，低光强和低温以及p h 的低( 7 ) 或高( 9 2 ) 有助于藻毒素的产生【9 】。营养盐的 浓度对毒素的产生也有很大的影响，但不同种类的营养盐作用不一，氮和碳影响 不明显，磷的作用较明显，在微量元素中，c d 、c r 、c u 、n i 和s n 对毒素产生无 影响，而f e 、z n 影响极明显，在b g 1 l 培养基中，降低f e 和z n 的浓度都会明显地 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 提高毒素的产生1 1 0 】。o r r 等人发现铜绿微囊藻的毒素产率与细胞分裂速率呈很好 的相关性，认为环境因子并不直接作用于毒素产生的代谢途径，而是通过影响细 胞分裂速率来控制毒素的产生阁。近期的一项研究结果表明，微囊藻细胞的能量 状态即腺甘酸能荷控制着毒素的产生，因此任何影响腺昔酸能荷的因素都会调节 毒素的产生，其中光照、营养( 如磷、铁) 的作用最大【l l 】。 1 3 微囊藻毒素的结构和理化性质 微囊藻毒素是一类具有生物活性的七肽环状肝毒素，分子量在1 0 0 0 左右。 m c 的一般结构为环( d 丙氨酸l - x 赤p 甲基d - 异天冬氨酸- l y - a d d a - d 异谷 氨酸- n - 甲基脱氢丙氨酸) ，或写作( d a l a l - x - d m a s p l y - a d d a d - g l u m d h a ) b 2 ，其中n 一甲基脱氢丙氨酸( m d h a ) 是一种特殊氨基酸，含有a ，p 不饱键；a d d a ( 3 氨基9 甲氨基- 2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基癸6 二烯酸) 是特殊的2 0 个碳原子的氨基酸， 是m c 生物活性表达所必须的，去除a d d a 后毒素的毒性降低，由于位置2 和4 的两 个l - 氨基酸( ) ( 与y ) 的不同及m a s p 和a d d a 的甲基化去甲基化产生的差异，可以形 成多种不同异构体。目前己从不同微囊藻菌株中分离、鉴定了6 0 多种微囊藻毒素 结构。当4 位置的氨基酸( y ) 为精氨酸，2 位置的氨基酸( x ) 分别为亮氨酸、精氨酸、 酪氨酸时，所表示的m c 分别为简称m c l r ，m c - r r 与m c y r t ”】。 由于环状结构和间隔双键，m c 具有相当的稳定性，加热煮沸( 水浴1 0 0 ( 2 ， 3 0 m i n ) 未能使之分解，而干燥的m c 在室温条件下则可以保存数年之久。尽管它 图1 微囊藻毒素的化学结构 f i 9 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f m i c r o c y s t i n 们是多肽类物质，但普通的蛋白质水解酶 对它们不起作用【1 4 1 。m c 易溶解于水，在 水中的溶解度达1 9 l 以上，不易沉淀或被 吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中。由于m c 分子结构含有羧基、氨基和酰氨基，所以 在不同p h 下，m c 有不同的离子化倾向。 m c - l r 的正辛醇水分配系数( 1 0 9 d o w ) 从 d h 为l 的2 1 8 降至1 p h 为1 0 时的1 7 6 ，因此 在爆发水华时的高p h ( 8 ) 条件下，m c 的生 物富集效应小【1 5 1 南京师范大学硕士学位论文 藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 1 4 微囊藻毒素的危害与毒性 自从1 8 7 8 年f r a n c i s 首次发现泡沫节球藻( n o d u l a r i as p u m i g e n a ) 水华引起家畜 及禽类中毒死亡以来，有关藻类水华引起的野生动物、鱼类、家畜、家禽及宠物 中毒、死亡的报道很多，其中以微囊藻水华的危害最严重、广泛。动物通过直接 接触或饮用含有m c 的水而中毒，中毒症状主要有昏迷、肌肉痉挛、呼吸急促、 腹泻，甚至在数小时以至数天内死亡。研究证明，中毒死亡主要是由于肝损伤， m c 造成肝内出血甚至肝坏死。m c 对动物的毒害程度主要与水华密度、水体毒 素含量有关，也与动物种类和大小有关。单胃动物没有反刍动物和鸟类敏感【1 6 ，”】。 m c 也同样危害人类健康。人们直接接触含有毒素的水华，如在湖泊、河流、 水库中进行游泳等娱乐活动，会引起皮肤、眼睛过敏，发烧，疲劳以及急性肠胃 炎，如果经常暴露于含有毒素的水体，会引发皮肤癌、肝炎及肝癌。1 9 9 6 年在巴 西发生了1 0 0 多人因藻毒素而发生急性肝功能故障其中至少5 0 人死亡，引起举世 瞩目呻1 。在江苏太湖流域开展的横断面调查表明，饮用水中不同浓度的m c 可导 致人群肝脏酶学指标的变化，随着水中m c 浓度增加，人群的s - g p t 和c - g t 的水 平也升高，其间存在显著性差异( p 1 0 0 0 m g k g ，则可视为无毒 1 2 7 1 。此外还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究，以细菌 进行生物分析也有报道 3 0 , 3 1 1 。生物毒理检测法是最早采用的常规方法。它简便直 观，但需消耗较多毒素，灵敏度和专一性不高，无法准确定量，也不能辨认m c 4 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒索的研究 的异构体类型。因此，生物测试通常只作为毒素的最初筛选方法，要想准确地测 定毒性，必须在毒素粗提后，利用化学或生化方法进行检测。 化学分析方法主要采用色谱分析方法，常用的有薄层色谱( t l c ) 、气相色谱 ( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 和液相色谱质谱分析( l c m s ) t 3 2 j 。气相色谱只能测 定m c 的总量，薄层色谱易于操作，不需特殊设备，也不很耗时，可达n g 级的检 测水平。普通和反相高效薄层色谱也是肝毒素的提取、纯化的简便快速方法。高 效液相色谱是应用最为广泛的一种检测方法，它可以准确地定性、定量检测m c ， 也可以用于微囊藻毒素的分离纯化，紫外检测器( u v d ) 是h p l c 应用最普遍的检 测器，微囊藻毒素的最大吸收波长是2 3 8 m m t ”j 。h p l c 法通常可达n g 级的检测水 平，改进的方法甚至可达p g 级。与质谱或核磁共振联用确定其分子式和结构。 h p l c 监测技术往往需要标准毒素，而目前发现6 0 多种m c ，多数缺乏标准毒素， 这制约了h p l c 的进一步应用。l c m s 技术很好解决了这一问题，即使没有标准 毒素，只要知道种毒素的分子量，就可对其进行定性，而且l c m s 技术亦可对毒 素进行精确定量【3 4 1 。h a r a d a 所建立的电离子化气相色谱，质谱分析方法( e i g c m s ) 可以在半小时内完成对毒素的检测【3 5 i ，达n g 级检测水平。最近又发展了毛细电泳 ( c e ) 法后者分析速度快，具有柱上富集功能并应用激光诱导荧3 七( l i f ) 检测器提高 灵敏度，此外，同生化检测法相比，c e 易于实现自动化，避免放射性物质。因 为m c 的种类繁多且对人类和动物的毒性效应比较相似，故日本学者研究出了测 定总m c 的方法【3 6 1 ，其原理是用碘酸钠和高锰酸钾对m c 进行初步氧化后，可产生 一种共同的中间产物赤1 2 甲基3 甲氧基4 苯基酪酸( m m p b ) ，通过用气相色谱 对m m p b 进行测定，间接获得总m c 的浓度，但无法对各种m c 的类型进行区分。 生物化学分析m c 主要有酶联免疫( e l i s a ) 技术和蛋白磷酸酶抑制监测( p p i a ) 技术。2 0 世纪8 0 年代开始，e l i s a 技术应用于m c 的监测中，此后e l i s a 方法不 断得到完善和发展。e l i s a 方法专一性强，灵敏度高，操作简便1 3 7 , 3 a l ，而且目前 已有m c l r 的商品试剂盒出售，灵敏度可达n g 甩级水平，是一种很有发展潜力的 方法。但e l i s a 法只能监测某一特定毒素，对某些毒素的交叉反应低，不能监测 所有的毒素，而且试剂盒目前费用过高，在一定程度上阻碍其在常规监测中的运 用。p p i a 技术主要根据m c 能抑制蛋白磷酸酶i 和2 a 的活性，从而通过酶活性的 受抑制程度来监测毒素含量，该技术监测限度可达p g 级 3 9 , 4 0 1 。这种监测技术灵敏 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒索的研究 度高，但监测的是毒素总量，而且蓝藻本身具有的内源蛋白磷酸酶活性有可能使 监测结果偏低。 由于特殊的多肽合成酶基因m c y b t y ( 存在于产毒的微囊藻藻株中，因此可通 过对该基因的p c r 扩增检测来判断产毒株和非产毒株微囊藻【4 i j 。微囊藻产毒特征 的p c r 监测法仅局限于产毒株和非产毒株的判断，不能定性定量监测毒素含量， 此9 b d n a 样品的制备过程复杂，限制了该方法的推广运用。此方法一般可应用 于有毒微囊藻分布规律研究及有毒水华的预测预警1 4 2 】。 3 微囊藻毒素的水处理技术 鉴于m c 对人体的危害性。必须对其进行控制、消除，首先是要控制消除蓝 藻水华，其次是通过各类净水技术去除藻类及其毒素。常规水厂工艺( 混凝、沉 淀、过滤、加氯消毒1 对去除藻细胞有一定效果，因而可部分去除细胞内藻毒素， 而对细胞外藻毒素去除率较低甚至为负值( 部分细胞内藻毒素释放水t 4 ”。目前 藻毒素的水处理技术主要分为物理、化学和生物处理三类。 3 1 物理方法 3 1 1 活性碳吸附 水处理工艺中最常用的活性炭滤料( a c ) 为颗粒状活性炭( g a c ) 和粉末状活 性炭( p a c ) 。g a c 对含m c 3 0 5 0 嵋l 的水进行处理可去除9 0 以上，但其寿命有 限。水处理达7 0 0 0 1 0 0 0 0 活性炭容积时，其有效性降至1 j 6 3 ，可能是由于g a c 与 溶解性有机炭渗透影响吸附。p a c 的去毒效果与其浓度及接触时间有关，2 0 m g l p a c 可去除9 0 浓度为4 0 l g l 的m c 4 4 l 。大规模处理设备中，g a c 或p a c 伴传统 处理一般可减少水中m c 8 0 以上1 4 ”。有研究显示无生物活性的g a c 只能少量去 除m c ，暗示a c 的良好去毒效果来自其生物活性f 4 6 】。但是用过的g a c 高温高压灭 菌后，去毒效果下降。因此由于活性炭再生困难，使水处理费用增高。另外，活 性炭对m c 的去除效果与待处理水体中含有的天然有机物质的含量有关。有机物 的竞争吸附会造成m c 去除率的降低 4 7 1 。 3 1 2 膜滤及反渗透法 许多学者的研究发现，微滤膜( m f ) 或超滤( u f ) 对藻及细胞内毒素的去除效果 较好，可达9 8 4 “，超滤尤其有效，可能与它对m c 具有吸附力等特性有关。将m c 6 南京师范大学硕士学位论文藻茁复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 浓度为5 3 0 p g l 的水经纳米滤膜处理降到1 嵋l 4 8 1 。有学者用2 5 - 3 5 b a r 的反渗透膜 去除盐水中的m c ，阻留率达到了9 6 7 9 9 6 ，对细胞内外m c 效果均较理想【4 9 】。 但膜技术成本将非常高，所以目前只有少数发达国家进行小范围的应用。 3 2 化学方法 3 2 1 氯化 一般认为属于传统水处理工艺的氯化对藻毒素的去除基本没有作用。但 n i c h o l s o n 等的试验结果表明，氯化对m c 的去除效果与溶液的p h 有关，当p h 从7 升高至1 0 时，毒素的去除率从7 9 降低到了0 4 。t s u j i 等考察了次氯酸钠对 m c l r 和m c r r 的影响，认为m c 的去除率与游离氯的含量有直接关系。当游离 氯浓度为2 8 m g l 时，反应3 0 m i n 后有9 9 的毒素被去除；而游离氯降到0 7 m g l 时，反应6 0 m i n 后m c 只降低了3 5 ，加拿大某水处理厂的实验也表明对m c l r 进行氯化作用，能达到8 2 的处理效果1 5 0 】。 3 2 2 臭氧氧化 臭氧是强氧化剂，其氧化能力比次氯酸钠强两倍。含藻毒素的饮用水源水进 行臭氧化预处理，可有效降解藻毒素。研究表明臭氧能高效快速地去除m c ，臭 氧浓度是影响消毒效果的关键因素。h i m b e r g 等的研究结果显示0 2 m g l 的臭氧 可以消除1 6 6 0 的藻毒素，浓度为o 6 m g l ，去除率可达8 3 以上【5 1 1 。穆丽娜 等用臭氧处理太湖水，水中藻毒素原始浓度为2 2 2 1 7 p g m l 时，只需要通臭氧 3 m i n ，水中臭氧浓度达0 3 m g l ，去除率可达9 9 t ”l 。 臭氧氧化性强，消毒效果佳，产生的有害消毒副产物少，因而较其他化学氧 化剂具有更为广阔的应用前景。不过臭氧处理普遍存在着臭氧利用率低、含量不 高、有效氧化能力不足、运行成本相对昂贵等问题，限制了其应用。 3 2 3 光降解与光催化氧化 m c 侧链a d d a 基团具有对紫外光敏感的共轭双键结构，可以通过紫外光的照 射破坏i d d a 基团而去毒，去除率与光强及时间有关。若用阳光照射，则会产生 a d d a 共扼二烯烃的某种异构体。在光强4 7 t t w c m 2 的u v 照射下m c l r 的半衰期为 l o m i n ，经光强为2 5 5 0 r t w c m 2 的u v 照射1 0 m i n 见i 毒素被完全分解，色素对m c 的 光降解起重要作用，并且其含量将决定藻毒素的降解度【5 3 】。t s u j i 等曾报道在阳 光照射下，日本k a s u m i g a u r a 秸j 的蓝藻色素对m c 有不同影响，即使在j j i l k 5 m g m l 的高浓度色素提取液时，使0 0 0 7 1 4 m g l 的藻毒素降解5 0 也需6 8 d 。w e l k e d 5 8 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 发现在腐殖质存在时，m c 在太阳光下浓度显著减少，而在相同条件下，纯水中 的m c 却很稳定。 光催化氧化是比光降解更为有效的降解藻毒素的方法。f e i u t z t ”1 分别以紫外 灯和日光照射铜绿微囊藻的水提取液，发现藻毒素浓度均没有变化，只有在日光 照射并加入光催化剂t i 0 2 后，m c 才会显著降解，使8 0 嵋j l 的初始浓度降低5 0 需5 1 5 r a i n 。陈晓国f s 7 1 等发现t i 0 2 膜的存在可以加速m c r r 在太阳光和u v a 下的 降解，在太阳光下效果尤为明显，而在u v c 下t i 0 2 膜却对m c r r 的降解具有抑 制作用。另外，p h 值对太阳光多孑l t i 0 2 膜体系催化氧化去除m c r r 具有定影 响，偏酸性条件有利于反应进行，但影响不是太大【5 8 】。 3 2 4 化学试剂氧化 普通氧化剂对藻毒素的处理效果不佳，但有研究发现高锰酸钾对细胞外毒素 消除效果较好，l m g l 高锰酸钾接触3 0 m i n 可去除9 5 m c ，但它对细胞内毒素的 消除效果较差，可能其不能穿透和裂解细胞而无法与细胞内毒素接触【4 8 】。c o r n i s h 等利用f e n t o n 试剂( 5 m m 的h 2 0 2 和o 5 m m 的f e 2 + 共同作用) 降解m c - l r ，结果显示 在3 0 r a i n 后就检测不到藻毒素的存在，他们认为此方法的效果至少与t i 0 2 催化光 降解等同。若用等浓度的f e 3 + 代替f e 2 + ，亦有降解效果，只是速度较慢【5 9 1 。 3 - 3 生物降解 生物降解也是m c 自然降解的主要途径。已发现能够降解m c 的细菌广泛存 在，在污水沟、湖水、沉积物和河水中均已发现降解m c 的水生细菌，虽然微生 物降解是去除m c 的一条非常有前途的方法，但m c 的环状结构和间隔双键具有 相当的稳定性，一般的多肽水解酶不能对m c 进行分解，只有一些特殊的微生物 菌种具备对m c 的降解能力。 尽管m c 降解菌普遍存在，然而迄今为止，被分离和详细研究的纯种m c 降 解菌株却很少。澳大利亚学者j o n e s 等1 6 0 l 在世界上首先成功筛选出了能够降解m c 的微生物菌种鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s s p ) 。t a k e n a k a 等【6 i l 发现从湖泊表层水 体分离出的5 种微生物菌种中，只有铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) 对m c 有降解能力，在初始5 0 m g lm c l i l 浓度下，2 0 d 的去除率达9 0 以上，并发现铜 绿假单胞菌所分泌的碱性蛋白酶主要负责催化降解m c l r 。p a r k 等【6 2 】在湖泊蓝藻 水华发生的水样中也分离出了1 株具备对m c - r r 、y r 和l r 都有降解能力的鞘氨 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s y 2 ) ，其对m c - r r 和l r 的最大降解速率分别达到每天 1 3 0 和5 4 m g l 。国内阎海率先从云南滇池底泥中分离出了能够降解m c 的微生 物纯菌种，经中科院微生物研究所鉴定为青枯菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 。研究发 现此菌种在3 d 内可将初始浓度分别为5 0 2 和3 0 1 m g 几的m c r r 和l r 全部降解， 日平均降解m c r r 和l r 的速率分别高达1 6 7 和9 4 m g l 。近几年来，s a i t o 等人分 别从日本k a s u m i g a u r a 湖分离m d 1 菌和从中国贵阳市一常发生水华的湖泊中分 离c 1 菌，发现其都具有降解m c 的能力，且都属鞘氨醇单胞菌属，而且发现它 们的生长受到p h 的影响，c 1 菌在碱性条件下更易生长哗】。综上所述，目前已筛 选到的6 种m c 降解菌，其降解能力和测试条件见表1 【6 5 1 。不过降解率与培养液中 的细菌细胞密度有关，在以上研究中，由于细菌的细胞密度数据不全，因此并不 能通过所列数据判定以上数种细菌降解能力的高低。 表1m c 降解菌降解能力的比较 t a b1c o m p a r i s o no f m cb i o d e g r a d a t i o nb yd i f f e r e n tb a c t e r i a n 无数据 在m c 降解途径和分子机理研究方面，因为m c 具有环状结构，一般认为首先 打开肽链环使其变成线性多肽，然后进一步降解成四肽化合物，再降解为小分子 多肽和氨基酸，降解过程是一个解毒的过程。澳大利亚学者b o u r n e 等嗣研究了鞘 氨醇单胞菌降解m c l r 的途径，发现至少有3 种酶参与了m c - l r 的代谢过程。并 9 南京师范大学硕士学位论文藻菌复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 将对应的基因进行了克隆和分子特点识别分析。编码三种水解酶的d n a 片段为 5 8 k b ，包括m i r a ，m l r b ，m l r c ，m l r d 基因，其中m i r a 编码微囊藻毒素酶( m i r a ) 它是降解过程中的第一个酶，是0 h 3 3 6 个残基组成的肽链内切酶是一种金属蛋白 酶，在该酶的催化下将m c l r 开环变成线状的m c l r ：位于m i r a 下游且具有相 同翻译方向的是m l r d ，是一个伴随在m i r a 旁边的寡肽转运子；m l r b 位于它们的 下游并具有相反翻译方向，由它编码的酶m l r b ( 4 0 2 个残基) ，可以将线形m c - l r 分裂成四肽；最后的基因m l r c 位于m i r a 上游具有相反的翻译方向，它编码的酶 m l 疋( 5 0 7 个残基) 可以降解四肽，是一种金属蛋白酶。s a i t o 等人通过p c i 滥测 m i r a 基因，发现具有降解能力的y 2 菌、m d 1 菌都含有m i r a 基因且基因和m j p v 具有很高的同源性，通过1 6 s r d l n a 分析发现其均属于鞘氨醇单胞菌属，但其他没 有降解能力的鞘氨醇单胞菌属却没有m i r a 基因，因此作者推测含有m i r a 基因只存 在降解菌中，而不存在于鞘氨醇单胞菌属1 6 ”。 藻毒素的生物降解研究主要集中在实验室内纯藻毒素与水环境中藻毒素的 降解，应用性的水处理工艺中藻毒素的生物降解仅有几篇文献报道。k e i j o l a 等发 现慢砂滤中部分蓝藻毒素通过生物降解而除去。吴振斌等【6 8 1 以含蓝藻水华的鱼塘 水为进水，考察了两套上行流下行流人工湿地系统对m c 的去除效应。进水藻毒 素浓度为0 1 1 7 “g l 时，两套系统去除效率分别为6 8 5 和3 4 6 。菱白石首蒲组 合的湿地系统出水中溶解氧及电位较高，抑制了厌氧细菌的活动，对藻毒素的去 除效率只有处于厌氧状态的芦苇水葱组合系统的l 2 。作者认为厌氧系统有利于 藻毒素的降解，基质的吸附和细菌的降解是去除藻毒素的主要机制。吕锡武等【6 9 1 采用序批式生物膜反应器对m c - l r 、r r 、y 财行了生物降解试验研究。好氧处 理后1 2 h 时，m c - r r 、y r 和l r 的浓度3 6 3 4 、1 7 8 3 、1 1 6 1 l p g l 分别降至5 0 2 、3 5 9 、 1 5 0 1 峙l ，在2 4 h 时去除率超过9 0 ，7 2 h 时检测不到m c 。好氧生物处理对藻毒 素的生物降解远比厌氧生物处理工艺有效。好氧反应器中存在大量草履虫，吞食 蓝藻、细菌和颤体虫的分泌物，反应器中草履虫多时，蓝藻和m c 的去除效果好。 4 固定化微生物在水处理中的研究进展 4 1 固定化细胞的制各方式 国内外尚无统一的分类标准，一般分交联法、共价结合法、吸附法和包埋法4 1 0 南京师范大学硕士学位论文藻茁复合固定化祛除微囊藻毒素的研究 种。( 1 ) 交联法：利用双功能或多功能的试剂，直接与细胞表面反应基团( 氨基、酚 基、烃基等) 进行反应，使细胞彼此交联，形成网状结构。常用交联剂有戊二醛、 甲苯二异氰酸脂、双偶联苯胺等。但此法反应条件比较激烈，对微生物细胞影响 很大，且造价昂贵，因此应用受到限制。( 2 ) 共价结合法：利用细胞表面反应基团( 氨 基、巯基、烃基、咪唑基等) 与已活的无机或有机载体相反应，形成共价键来制 得固定化细胞。此法中，微生物大多死亡，应用并不广泛。( 3 ) 吸附法：分物理吸 附和离子吸附两种。物理吸附是通过物理方法将微生物细胞吸附到载体表面使之 固定化，该法操作易行、反应条件温和、载体可重复使用，但细胞结合不牢易脱 落；离子吸附指通过离子键合作用固着于带有相异电荷的离子交换剂( d e a l s 纤 维、d e a l s s e p h a d e x 、c m - 纤维等) 上。( 4 ) 包埋法：将微生物细胞包埋在凝胶的微 小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内，包埋可分为微胶囊法和凝胶包埋法。 包埋法是最常见的细胞固定化方法，其操作简单，对细胞活性影响小且制备的固 定化细胞球强度高，被广泛用于废水处理研究。 4 2 固定化细胞的载体 理想的固定化载体应具有对微生物细胞无毒、传质性能好、性质稳定、使用 寿命长、价格低廉等特点。目前常用的载体大致可分为有机载体、无机载体和复 合载体3 大类。有机载体还可分为两类：一类是高分子凝胶载体，如琼脂、角叉 莱胶和海藻酸钙等；一类有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰铵凝胶、聚乙烯 醇凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。琼脂、海藻酸钠( c a ) 、聚乙烯醇( p v a ) 、 聚丙烯酰胺( p a m ) 等，它们在形成凝胶时可将微生物细胞包埋在凝胶内部从而达 到固定细胞的目的，在废