（动物学专业论文）稀有鮈鲫gobiocypris+rarus脑垂体结构及pomc基因cdna序列克隆和分析.pdf

摘耍 稀有觞鲫( g o b i o c y p r i sr a r u s ) 脑垂体结构 及p o m c 基因c d n a 序列克隆和分析 动物掌专业硕士生：刘小红 指导教师：王志坚副教授 摘要 稀有觞鲫( g o b i o c y p r i sr a r u s ) 隶属于鲤形目( c y p r i n i f o r m e s ) 鲤科 ( c y p r i n i d a e ) 鱼丹亚科( c a n i o n i n a e ) 觞鲫属，是中国特有的小型淡水鱼类。 运用常规组织学方法，以m a l l o r y s 一步三色法，a f 染色法为主，辅于铅苏 木精等方法，并以h e 法为对照，观察了稀有购鲫脑垂体的结构。稀有纳鲫的脑 垂体呈肾形，由神经垂体和腺垂体组成，整个垂体通过垂体柄与下丘脑相连。腺 垂体为垂体前外侧部( i 冲d ) ，垂体中外侧部( p p d ) 和垂体中间部( p i ) 三部分。 神经垂体及其分支深入腺垂体的各部分，在p i 中分布尤为丰富。分布于整个脑 垂体中的血管丰富。 克隆各种垂体激素c d n a 序列，并设计相应的反义r n a 探针。切片原位杂 交结果显示，p r l 阳性细胞主要分布在r p d 区域，在p p d 中也有少量零散分布。 p o m c 阳性细胞主要分布于r p d 和p i 区域，r p d 内的p o m c 阳性细胞形状不 规则，呈分散状，偶有几个细胞积聚成团；p i 内的细胞沿着神经垂体分支分布， 细胞较大，胞质染色深。另外，在p p d 中也发现了少量的p o m c 阳性细胞。g h 阳性细胞主要成群分布在p p d 中，在r p d 中也有极少量分布。细胞圆形，椭圆 形或三角形。f s h p 阳性细胞主要分布在r p d 、p p d 区域，p i 中有少量分布。 细胞圆形，椭圆形或不规则形，单个或者少数细胞成团分布。l h b 主要是单个或 者集群分布在p p d 中，在p r d 和p i 中有零星分布。分布于p p d 中的阳性细胞 形成一规则弧形，成为与p i 的分界线。t s h b 在整个垂体中都有分布，在p p d 背面集群分布，在r p d 和p i 中单个零散分布。g t h a 阳性细胞分布范围广，在 两雨人学坝i 。学位论文 r p d 、p i 、p p d 中均有分布；以p p d 数量最多，且与l h p 相似，分布于p p d 后 缘的阳性细胞形成一弧形，成为p p d 与p i 的明显界限。s l 阳性细胞数量较少， 仅在p i 后缘腹面有少量阳性细胞成团或分散分布。垂体激素产生细胞在垂体中 的分布具有个体差异性。 运用r t - p c r 和r a c e 方法从稀有觞鲫脑垂体中克隆出了p o m c 基因的 c d n a 序列。得到的稀有觞鲫p o m c ( r m p o m c ) c d n a 长8 4 6 b p s ，o r f 长 6 6 6 b p s ，编码信号肽( s p , m e t l _ a l a 2 8 ) ，n 端多肽( g l n 2 9 - h i s l 0 5 ) ，a c t h ( s e t l 0 8 m e t l 4 6 ) ，q m s h( s e t l 0 8 - g a l l 2 1 ) ，c l i p( p r 0 1 2 6 m e t l 4 6 ) ，p - l p h ( g l u l 4 9 _ h i s 2 2 1 ) ，7 - l p h ( g l u l 4 9 _ s e r l 8 6 ) ，1 3 - m s h ( a s p1 7 0 - s e r l 8 6 ) 和p - 内啡 肽( d e p ，x y r l 8 i n 2 2 1 ) 。没有发现与一- m s h ( 四足类p o m c 的特点) 同源的 序列存在。多序列同源性分析发现氨基酸序列与鲤鱼的p o m c i 和p o m c i i 具 有最高的相似性，为9 2 4 ，支持了稀有觞鲫应属于晌亚科的观点。系统进化树 分析表明稀有胸鲫的p o m c 序列属于p o m c a 。 运用r t - p c r 和原位杂交技术分析了r m p o m c 基因的垂体和垂体外组织表 达情况。阳性细胞主要分布在r p d 和p i ，也有少数阳性细胞分布在p p d 。垂体 外组织，包括脑、小肠、性腺、肝胰脏、脾脏和鳃都检测到了r m p o m cm r n a 的表达，表明在这些组织中，p o m c 存在旁分泌作用方式。 关键词：稀有绚鲫( g o b i o c y p r i sr a r u s ) ，脑垂体，结构，垂体激素细胞，p o m c ， e d n a 克隆，垂体外表达 b s t r a c t t h ep i t u i t a r ys t r u c t ur eo fr a r em i n n o w ( g o b i o c y p r i s r a r u s ) a n dc l o n i n g ，a n a l y s i so fp o m cc d n a a u t h o r ：l i ux i a o h o n g ( m a j o r ：z o o l o g y ) s u p e r v i s e db ya s s o c i a t ep r o f e s s o r ：w a n gz h i j i a n a b s t r a c t r a r em i n n o w ( g o b i o c y p r i sr a r u s ) ，b e l o n g i n gt oo r d e ro fc y p r i n i f o r m e s ，f a m i l y o fc y p r i n i d a e ，s u b f a m i l yd a n i o n i n a e ，g e n u sg o b i o c y p r i s ，i sas m a l lf r e s h w a t e rf i s h e n d e m i ct oc h i n a t h es t r u c t u r eo fr a r em i n n o wp i t u i t a r yw a so b s e r v e db yh i s t o l o g ya n d h i s t o c h e m i s t r ym e t h o d s a sak i d n e y , t h ep i t u i t a r yo fr a r em i n n o ww a sc o m p r i s e do f n e u r o h y p o p h y s i sa n da d e n o h y p o p h y s i s ，a t t a c h i n gt ot h eh y p o t h a l a m u sb yap i t u i t a r y s t a l k a d e n o h y p o p h y s i sw a s d i v i d e di n t ot h r e ep a r t s ，r p d ，p p da n dp ia c c o r d i n gt o t h ed i s t i n c th i s t o c h e m i s t r i c a lc h a r a c t e r i s t i c s t h ec u r v e db r a n c h e so fn e u r o h y p o p h y s i s w e r ei n s e r t e di ne v e r yp a r to fa d e n o h y p o p h y s i s ，a n dw e r em o s tp l e n t i f u li np i t h e b l o o dv e s s e l sw e r er i c hi na l lp a r t so ft h ep i t u i t a r y c r n ap r o b e sw e r ed e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h e c l o n e dc d n a so fp i t u i t a r y h o r m o n e s d a t as h o w st h a t ：p r l p o s i t i v ec e l l sw e r em a i n l yd i s t r i b u t e di nr p d ，a n d f e ww e r es c a t t e r e di np p d p o m cp o s i t i v ec e l l sl o c a t e di nm o s tp a r to fr p da n dp i ， w i t hp a t t e r n so fd i s p e r s e da n dc o m p a c ta l o n gt h ep nb r a n c h e s ，r e s p e c t i v e l y i n a d d i t i o n ，t h e r ew e r es o m ep o m cp o s i t i v ec e l l so b s e r v e di np p d g hp o s i t i v ec e l l s w e r em a i n l yg r o u p e di np p d ，f e wf o u n di nr p d ，i nas h a p eo fr o u n d ，o v a lo rt r i a n g l e f s h l 3p o s i t i v ec e l l sl o c a t e di nr p d ，p p da n df e wi np i ，i nas h a p eo fr o u n d ，o v a lo r i r r e g u l a r l h l 3p o s i t i v ec e l l sd i s t r i b u t e di np p d a l o n eo ri ng r o u p ，a n df e wc e l l sw e r e a l s of o u n di nr p da n dp i t h e r ew a sad i v i d i n gl i n ei np p da n dp i ，f o r m e db yl h l 3 p o s i t i v ec e l l s t s h l 3 m a i n l yg r o u p e di nt h ed o r s a lp a r to fp p d ，f e ws c a t t e r e di nr p d a n dp i g t h a p o s i t i v ec e l l sw i t hal a r g ed i s t r i b u t i n ga r e a ，d e t e c t e di ne v e r yp a r to ft h e p i t u i t a r y , m o s t l yi np p d ，a n df o r m e dad i s t i n c tl i m i tb e t w e e np p da n dp il i k et h el h l 3 i i i 两南人学硕l j 学化论文 p o s i t i v ec e l l s t h e r ew e r ef e ws lp o s i t i v ec e l l sd e t e c t e d ，a n dt h e s ec e l l sw e r eg r o u p e d o rs c a t t e r e do n l yi np o s t e r i o r - v e n t r a lp a ro fp i t h ed i s t r i b u t i n gp a t t e m so fh o r m o n e p r o d u c i n gc e l l sw e r ed i f f e r e n tf r o me a c hs a m p l e s ae d n ae n c o d i n gp r o o p i o m e l a n o c o r t i n ( p o m c ) g e n ew a sc l o n e df r o mt h e p i t u i t a r yg l a n do ft h e r a r em i n n o w ( g o b i o c y p r i sr a r u s ) ，as m a l lf r e s h w a t e rf i s h e n d e m i ct oc h i n a t h i sw a sa c h i e v e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( r t - p c r ) a n dr a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ( r a c e ) d a t as h o w e d t h a tt h ep r e d i c t e dr a r em i n n o wp o m c ( r m p o m c ) e d n ac o n s i s t e do f8 4 6 b p s c o d i n gf o rt h ef o l l o w i n gs e q u e n c e s ，f l a n k e db yp r o t e o l y t i cc l e a v a g es i t e s ：s i g n a l p e p t i d e ( s p , m e t l - a l a 2 8 ) ，n t e r m i n a lp e p t i d e ( g i n 2 9 - h i s l 0 5 ) ，a c t h ( s e r l 0 8 - 州e t l 4 6 ) ，0 【m s h ( s e r l 0 8 m a l l 2 1 ) ，c l i p ( p r 0 1 2 6 扎l i e t l 4 6 ) ，p - l p h ( g l u l 4 9 - h i s 2 2 1 ) ，7 - l p h ( g l u l 4 9 - s e r l 8 6 ) ，1 3 - m s h ( a s p1 7 0 s e t l 8 6 ) ，a n d 1 3 - e n d o r p h i n ( d e p , t y r l8 9 毛l n 2 2 1 ) s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dn or e g i o nw a s h o m o l o g o u st o7 - m s h ( at e t r a p o dp o m cf e a t u r e ) t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ei s h i g h l ys i m i l a rt op o m c ia n dp o m c i io ft h ec o m m o nc a r p ( 9 2 4 ) ，w h i c h s u p p o r t i n gt h ev i e w p o i n to fr a r em i n n o wb e l o n g st os u b f a m i l yg o b i o n i n a ea c c o r d i n g t oh o m o l o g o u sa l i g n m e n t i tw a sp o m c a t h r o u g ht h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i s p i t u i t a r ya n de x t r a - p i t u i t a r ye x p r e s s i o nw e r es t u d i e du s i n gr t - p c ra n di ns i t u h y b r i d i z a t i o n r m p o m cp o s i t i v ec e l l sw e r em a i n l yl o c a t e di nt h er o s t r a lp a r sd i s t a l i s ( r p d ) a n dp a r si n t e r m e d i a ( p i ) s o m er m p o m c p o s i t i v ec e l l s w e r ed e t e c t e di n t h ep r o x i m a lp a r sd i s t a l i s ( p p d ) a sw e l l ，a c c o r d i n gt o ns t uh y b r i d i z a t i o n i nt h e e x t r a - p i t u i t a r yt i s s u e s ，p o s i t i v es i g n a l sw e r eo b s e r v e di nt h eb r a i n ，i n t e s t i n e s ，g o n a d s ， h e p a t o p a n c r e a s ，s p l e e n ，a n dg i l l sb yr t - p c ra n a l y s i s ，s h o w i n gt h a tt h ep a r a c r i n e p a t h w a yw a se x i s t e di nt h e s et i s s u e s k e y w o r d s ：r a r em i n n o w ( g o b i o c y p r i sr a r u s ) ，p i t u i t a r y , s t r u c t u r e ，h o r m o n ep r o d u c i n g c e l l s ，p r o - o p i o m e l a n o c o r t i n ( p o m c ) ，c d n ac l o n i n g ，e x t r a p i t u i t a r ye x p r e s s i o n i v 独创性声明 学位论文题目：j 军豇越堙尊上厶“唾臻驰泣丝苎丝乙避瘟幺汹 盆2 蚴色基因c 勃蛤巷幽壹2 龌担坌聱 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：翻t 心芗土 签字日期：o o o 年易月4 - 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：骄保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名i导师签名：河岂 签字日期：年月 日 签字日期：押fo 年6 月，j 日 文献综述 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼! ! ! ! 皇曼曼曼曼! 曼曼! 曼曼曼曼! 曼量曼曼曼曼曼舅曼曼曼曼曼曼曼鼍- - - i ii i。i = 曼曼甍 1 文献综述 1 1 鱼类脑垂体结构及研究 1 1 1 鱼类脑垂体结构 垂体，为鱼类重要的内分泌器官之一，通过下丘脑垂体靶器官轴连接神经 系统与内分泌系统，参与了包括生长，发育，生殖，代谢，渗透压等各种生理活 动的调节。 随着哺乳类动物垂体的大量研究成果的发表，鱼类，作为一种较为低等的脊 椎动物也开始成为垂体研究的对象。鱼类垂体的研究始于2 0 世纪3 0 年代。早在 1 9 3 7 年，b e l l 和c h a r i p p e r 就开始了对鲫鱼垂体研究，主要是在形态学和细胞生 物学方面的描述( b e l l ，1 9 3 7 ；c h a r i p p e r , 1 9 3 7 ) 。根据鱼类脑垂体的不同形态，国 外学者把垂体分为细长型和扁平型，而国内的学者把垂体分为前后型和背腹型。 鱼类脑垂体包括腺垂体和神经垂体，腺垂体可以分为前腺垂体( r p d ) ，为吻端 远侧部垂体；后腺垂体( p p d ) ，近端远侧部垂体；中腺垂体( p i ) ，垂体中间部 三部分；神经垂体包括神经部和漏斗即垂体柄( 林浩然，2 0 0 2 ) 。 腺垂体的三部分可以根据各自所含细胞的不同生化属性而用各种不同的试 剂染色而区别开来。例如：用h e r l a n t 氏阿利新蓝( a b ) 一过碘酸雪夫( p a s ) - - - o g 染液对腺垂体进行染色，若细胞的分泌物具有糖基，且为嗜碱性细胞，则可以被 p a s 试剂染成紫红色，有些分泌物被氧化后出现酸基，则可以被a b 染成蓝色，另 外也可以用铅苏木精染成黑褐色。若细胞的分泌物不含糖蛋白或酸基，且为嗜酸 性细胞，则可以被o g 染成呈黄色；利用o g 和藻红复合染色，贝j j o g 可以将中腺 垂体内的嗜酸性细胞染成橙黄色，而前腺垂体中的嗜酸性细胞可以被藻红染成红 色。另外一些未分化或者正在发育的分泌细胞为嫌色细胞，一般不被染色( 杜卓 民，1 9 9 8 ) 。 随着分子生物学技术的发展，鱼类脑垂体的结构也得到了更好的研究。鱼类 脑垂体主要有8 种内分泌细胞并分别合成和释放催乳素( p r o l a c t i n ，p i 也) ，促肾上 腺皮质激素( a d r e n o c o r t i c o t r o p h i ch o r m o n e ，a c t h ) ，生长激素( g r o w t hh o r m o n e ， g h ) ，促卵泡激素( f o l l i c l es t i m u l m i n gh o r m o n e ，f s h ) ，促黄体生成素( l u t e i n i z i n g 两南人学硕l 学位论文 h o r m o n e ，l h ) ，促甲状腺激素( t h y r o i ds t i m u l a t i n gh o r m o n e ，t s h ) ，黑色素细胞 刺激素( m e l a n o p h o r es t i m u l a t i n gh o r m o n e ，m s h ) ，生长促乳素( s o m a t o l a c t i n ，s l ) ； l h 和f s h 统称为促性腺激素( g o n a d o t r o p i n ，g t h ) ( 谢碧文，2 0 0 8 ) 。通过免疫 组化和原位杂交等技术，发现大多数的鱼类，女n w e e v e rf i s h ( t r a c h i n u sd r a c o ) ， r p l 细胞主要分布在r p d 以及p p d 的腹面的背部区域，a c t h 细胞主要分布在 r p d 区域中，与r p l 细胞和神经垂体分支相邻。g h 细胞主要分布在p p d 区域的背 面和腹面，成索状或分离状态，并与神经垂体发生联系。g t h 细胞主要分布在 p p d ，也有少量分布在r p d 。t s h 细胞主要分布在p p d 的前腹面。m s h 细胞和s l 细胞分布在p i 区域，并与神经垂体分支相互渗杂( s m a c h e zc a l ae ta l ，2 0 0 3 ) 。另 外些鱼类脑垂体，存在两种g t h 细胞，分别为f s h 细胞和l h 细胞，如大西洋 比目鱼( h i p p o g l o s s u sh i p p o g l o s s u s ) ，f s h 细胞在整个p p d 区域都有分布，不与 神经垂体分支接触；l h 细胞主要分布在p p d 区域，但在p i 的边缘也有分布，也不 与神经垂体分支接触( w e l t z i e ne ta l ，2 0 0 3 ) 。 在被认为是最古老的脊椎动物无颌类太平洋盲鳗( e p t a t r e t u sb u r g e r i ) 和澳大 利亚盲鳗( m y x i n e g l u t i n o s a ) ，其脑垂体也具原始性，其神经垂体和腺垂体被很厚 一层结缔组织完全分开，在海七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ) 和有颌类脊椎动物中 具有的远侧部( p a r sd i s t a l i s ，p d ) 和中间部( p a r si n t e r m e d i a , p i ) 之分的两部 分但在盲鳗中不存在，甚至不存在一个可鉴别的中间部或者正中隆起( m e d i a n e m i n e n c e ) ，脑垂体中仅发现了三种免疫活性细胞g t h 样细胞，g h p r l 样细胞， a c t h 样细胞，但没有检测到m s h 活性细胞( n o z a k ie ta l ，2 0 0 5 ) 。在同属于无 颌类的海七鳃鳗( p e t r o m y z o nm a r i n u s ) 垂体中，已经克隆出四种腺垂体激素： 促肾上腺皮质激素、黑色素细胞刺激素、生长激素和促性腺激素，这些细胞的数 量以及所占的面积，都会随着不同的生长周期而不同，并具有与高等脊椎动物的 相似激素的保守功能( n o z a k ie ta l ，2 0 0 1 ；n o z a k ie ta l ，2 0 0 8 ) 。七鳃鳗具有p o m 和p o c 两个基因( h e i n i ge ta l , 1 9 9 5 ；t m k a h a s h ie ta l ，1 9 9 5 ) ，t a k a h a s h i 等( 2 0 0 1 ) 认为这两个基因是在脊椎动物起源的早期经过基因复制衍生而来，即l r 基因组 复制。n o z a k i 等( 2 0 0 5 ) 认为盲鳗没有m s h 活性细胞，可能是其p o m c 基因， 没有被加工成m s h s 成熟肽，或是不具有p o m c 基因而只是有一个与七鳃鳗类 似的p o c 基因。由于盲鳗是目前已知的现存最古老的脊椎动物，其脑垂体不具 2 文献综述 有p i 结构，如果这个结构代表了垂体的最初状态，那么m s h 的活性被认为是在 p 1 分化出之后的一种二次获得性功能( n o z a k i ，2 0 0 8 ) 。而无脊椎动物以及属于 原索动物门的尾索动物海鞘，都具有m s h 类似序列( a m e m i y a e ta 1 ，1 9 9 9 ；l e ee t a 1 ，1 9 9 9 ；程开，1 9 9 9 ) 。有学者认为p o m c 出现于无脊椎动物，b ，和7 - m s h 是0 【m s h 在无脊椎的进化阶段复制而来，如果这个观点正确，那么在比无脊椎 动物高等的脊椎动物都应该有p o m c 基因，且有能编码m s h 的序列，则无颌类 盲鳗的p o m c 类似基因以及海七鳃鳗的p o c 基因缺失m s h 序列属于进化丢失 现象。 但比无颌类更为低等的原索动物头索类( c e p h a l o c h o r d a t e s ) 文昌鱼( 1 a n c e l e t ， a m p h i o x u s ) 的哈氏窝，以及尾索动物( p r o t o c h o r d a t e s ) 海鞘( s e as q u i r t s ) 的神 经复合体中都存在垂体样细胞，且分别可以产生促性腺激素，t s h ，p r l ，g h ( 方 永强，2 0 0 2 ) ，和促肾上腺皮质激素样物质( a d r e n o c o r t i c o t r o p i n 1 i k e ，a c t h 1 i k e ) ， 催乳素样物质( p r o l a c t i n - l i k e ) ，0 【促黑激素样物质( 仅m e l a n o c y t o s t i m u l a t i n g h o r m o n e 1 i k e ) ( 程开，1 9 9 9 ) 。无颌类脊椎动物的脑垂体中虽然没有 检测到t s h 免疫活性细胞，但己克隆出了t s h 受体基因，并发现定位在肾上腺 ( n o z a k i ，2 0 0 8 ) ，这表明这类动物存在t s h 细胞，依然能产生t s h 可能是由于 表达量较低或其它原因而没有被检测出来。也有学者认为脊椎动物中最为原始的 4 种激素为a c t h ，m s h ，g h ，g t h ，之后衍生出来的激素，如p r l ，t s h 等， 都与高等脊椎动物适应新的环境有关( k a w a u c h ie ta l ，2 0 0 2 ) 。更有学者认为， g h 家族激素和糖蛋白激素家族都是由相同的祖先基因经过基因复制以及之后的 分化而产生( n o z a k i ，2 0 0 8 ) 。总之，高等的脊椎动物其复杂的内分泌系统应该 使得其神经内分泌调节更为精密，从而能更好地适应变化的环境，得到更大的生 存空间。 所有的脊索动物都具有一个脑垂体或类似的结构，包括头索动物文昌鱼和尾 索动物柄海鞘都分别具有一个类似脑垂体结构的哈氏窝或神经复合体( 方永强， 2 0 0 2 ) 。与其它的高等脊椎动物相比，硬骨鱼类脑垂体没有拉克氏囊、垂体门脉 系统或动脉圆锥( k a w a m u r ae ta l ，2 0 0 2 ；s c u l l ya n dr o s e n f e l d ，2 0 0 2 ；c h a p m a ne ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。因此，硬骨鱼类的脑垂体是研究脊椎动物组织器官进化的一个很好的模 式器官。关于硬骨鱼类脑垂体与其它高等脊椎动物脑垂体的结构差异的形成原 两南大学硕l j 学f 毫论文 因，目前也有一些较为明朗的观点。斑马鱼前脑的卷曲发生在更靠近尾部的位置， 因此没有一个像拉克氏囊的结构形成，且高等脊椎动物在接下来的折叠和垂体原 籍的弯曲使脑垂体由最初前后型变为背腹型，而在斑马鱼仍是保留最初的前后型 ( c h a p m a ne ta l ，2 0 0 5 ) 。脊椎动物的脑垂体被认为是由一个具有化学感应的嗅 觉结构延伸而来( c h a p m a ne ta l ，2 0 0 5 ) 。文昌鱼的哈氏窝，通过口腔直接暴露 在外界环境中，被认为与脊椎动物脑垂体具有功能的同源性( w i c h ta n dl a c a l l i ， 2 0 0 5 ；c h a p m a ne ta l ，2 0 0 5 ) 。在高等脊椎动物中腺垂体由拉克氏囊产生，而拉克 氏囊被认为是由中脑的卷曲和中脑的的扩大产生，且是早期垂体外界环境联系的 进化遗留下，因此，脑垂体的进化对于脊椎动物与外界环境有一定关系( d u b o i s e ta l ，1 9 9 7 ) 。关于脑垂体的结构的研究，主要应用的方法有组织学，组织化学， 免疫组化，电镜，免疫电镜，原位杂交等，国内的研究多为集中于应用前三种方 法，研究经济，药用价值较高的鱼类的脑垂体的形态结构及发生。 1 1 2 鱼类脑垂体研究历程 鱼类脑垂体的相关研究，至今已近一个世纪。从最初的有关形态学和细胞学 结构的研究，已经发展了到垂体激素的克隆，体外表达，运用，转基因等各个方 面。 在对鱼类垂体的结构进行研究的同时，也进行了对鱼类脑垂体的提取物功能 和运用研究。特别是在2 0 世纪七八十年代，达到了垂体激素的分离提纯及功能 研究的顶点时期。分离提纯的方法主要为高压液相色谱、反相高压液相色谱、蛋 白质测序等，功能的分析主要基于垂体切除的实验鱼，在施加某种提纯的激素后 的表型研究( p i c k f o r d ，1 9 5 4 ；n o s oe ta l ，1 9 8 8 ) 。这些研究，得到了大量非常重要 的结论。如发现鲤鱼( c o m m o nc a r p ，c y p r i n u sc a r p i o ) 的脑垂体提取物中含有两种促 性腺激素亚基。它们分别与哺乳类促性腺激素的a l p h a 亚基和b e t a 亚基同源( j o l l e s e ta l ，1 9 7 7 ) 。表明了鱼类的促性腺激素为由两个亚基组成的异二聚体。之后，在 斑点鲟( s t a r r e ds t u r g e o n ，a c i p e n s e r s t e l l a t u s ) 中分离得到在结构和功能上具有异质 性但与性别和种群的多态性都没有关系的多种促性腺激素亚型( g o n c h a r o ve ta l ， 1 9 8 3 ) ，预示了多种促性腺激素在鱼类中的存在。1 9 9 1 ，m e r c h e l i d o n 等首次通过 各种高压液相色谱( h p l c ) 技术，在鳗鲡( a n g u i l l aa n g u i l l a ) 的脑垂体提取物中 纯化得到了一个分子量为3 1 4 k d a ，具有t s h 活性的异二聚体蛋白。其中一个 4 文献综述 亚单位的序列与鳗鲡的g t h i i o t 亚基相同，另外一个亚基的n 端区域的2 2 个氨 基酸与牛的t s h f l 有4 1 同源性，与鳗鲡的g t h i i 3 亚基具有3 6 同源性 ( m a r c h e l i d o ne ta l ，1 9 9 1 ) 。表明t s h 也是由两个亚基组成的异二聚体，且一个 为t s h 特有亚基，另一个则是同促性腺激素等共有的亚基。众所周知，哺乳类 基因组内只有一个p r l 基因，该基因表达的产物p r l 具有促进泌乳的功能。然 而1 9 8 5 年，s p e c k e r 从莫桑比克罗非鱼( o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c u s ) 脑垂体或者 从脑垂体细胞的培养基内分离纯化得到同源但却生化性质不同的两种蛋白，相对 分子量分别为2 0 k d a 和2 4 d a 的两种p r l s 。前者p r l 与哺乳类的相似，为酸性， 等电点为6 7 ，后者为碱性，等电点为8 7 。通过h p l c 和【3 h 亮氨酸追踪实验 的辐射h p l c 检测到两种p r l s 都可以高水平且等量分泌，都具有阻止生活于淡 水中，切除垂体的罗非鱼血浆中n a + 外流这个属于p r l 特有的功能( s p e c k e re ta l ， 1 9 8 5 ) 。这是首次从硬骨鱼类中分离得到两种功能性的p r l 。 随着生物学技术的飞速发展，对于鱼类脑垂体以及相关激素的研究已经不满 足与对垂体的结构或者脑垂体提取物的纯化和功能分析，对与激素基因的分析开 始称为了热点。虽然利用蛋白质测序的技术也获得了一些有关垂体激素基因的知 识，如分离出虹鳟( r a i n b o w t r o u t ，o n c o r h y n c h u s m y m s s ) 的生长激素基因，发现其长 4 k b ，含有6 个外显子( a g e l l o ne ta l ，1 9 8 8 ) ，以及对分离出的蛋白序列进行同源 性分析( d o r e se ta l ，1 9 9 3 ) 等。但随着p c r 技术的广泛运用，在2 0 世纪9 0 年 代，鱼类垂体激素基因克隆，体外表达才真正开始并迅猛发展，同时，转垂体激 素基因鱼类也开始载入史册。 1 9 9 1 年，k n i b b 等人运用p c r 技术，从两种海水鱼类澳洲黑鲷 ( a c a n t h o p a g r u sb u t c h e r i ) 和尖吻鲈( l a t e sc a l c a r i f e r ) 整个大脑的总r n a 中扩增得到g h 的c d n a 序列。分析表明，g h c d n a 序列在科级水平上具有高 度的保守性。并提出，p c r 是一个商业上和分类学上分离鱼类g h c d n a 序列的 快速方法( k n i b be ta l ，1 9 9 1 ) 。随后，从大西洋真鳕( a t l a n t i cc o d ，g a d u sm o r h u a ) 和大麻哈鱼( c h u ms a l m o n ，o n c o r h y n c h u sk e t a ) 的垂体c d n a 库中分别分离并 鉴定出了s lc d n a s 。结果表明鳕的s l 具有两个潜在的n 糖基化位点，而大麻 哈鱼的没有此位点。鳕，大麻哈鱼，牙鲆( f l o u n d e r ，p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 三 种鱼的s l 都具有与g h 和p r l 同源的6 个半胱氨酸残基，同时还都具有一个 两南人学硕1 学位论文 s l 特有的半胱氨酸残基。三种鱼的s l 的线性相关性比g h 高，因此提出了在鱼 类，s l 是一个属于g h p r l 家族，但比g h 更为保守的蛋白激素( t a k a y a m ae ta l ， 1 9 9 1 ) 。之后，开始将克隆出的激素基因e d n a 序列构建系统进化树，从进化上 老分析物种及激素。如r u b i n 等人运用p c r 技术从一种原始的辐鳍鱼类弓鳍鱼 ( a m i ac a l v a ) 脑垂体中克隆出的g h 基因e d n a 序列，与其它己知脊椎动物的 g h 序列构建了系统进化树，研究了辐鳍鱼类和肉鳍鱼类的g h 的进化关系， 结果表明弓鳍鱼g h 和真骨鱼类的聚为一支，鲟鱼和新鳍鱼类聚为一支，肺鱼和 蛙类聚为一支( r u b i na n dd o r e s ，1 9 9 4 ) 。同时，各种垂体激素基因的体外表达系 统也陆续被报道。早在1 9 9 1 年，鲔鱼( t u n a ，t h u n n u st h y n n u s ) 的g h 激素就已 经用微生物成功进行了体外表达( k i m u r a , 1 9 9 1 ) 。随后，大量关于脑垂体激素的 体外表达系统被建立和优化。1 9 9 5 ，p a d u e l 等人用e c o l i 为菌株，p e t l l a 表达 载体，外源性成功表达了具有刺激转染了兔生长激素受体的细胞的增殖功能的海 豚( c o r y p h a e n ah i p p u r u s ) c d n a 编码的蛋白( p a d u e le ta l ，1 9 9 9 ) 。同年，另外一种 高效率的原核表达重组的具有生物学活性的g h 蛋白的系统被建立( t s a je ta l ， 1 9 9 5 ) 。为了得到更高效率，更好质量的外源表达激素蛋白，1 9 9 7 年，鱼类g h 蛋白的表达系统再次被优化；用0 1 m m 的p 乳糖可以提高r g h 包涵体的表达量； 最适的变性和复性的条件为：6 m 的盐酸胍溶解包涵体，然后以3 5 0 0 的体积比 透析，透析液p h 为1 0 ，含有5 0 m m 的n h 4 h c 0 3 ，2 m m 的e d t a ，1 0 0 m m l 精氨酸，2 m m 氧化谷胱甘肽，2 m m 还原性谷胱甘肽( h s i he ta l ，1 9 9 7 ) 。该方法 克服了难以从鱼类垂体中提取大量天然g h 激素的困难，实现了用原核系统大量 表达有活性的g h 激素。 在转垂体激素基因方面，在2 0 世纪9 0 年代初就有了成功获得转g h 基因鱼 的报道。方法是用大绵鲥( o c e a np o u t ，m a c r o z o a r c e sa m e r i c a n u s )的抗冻基因 的启动子连上契努克鲑( c h i n o o ks a l m o n ，o n c o r h y n c h u st s h a w y t s c h a ) g he d n a ， 构建成嵌合基因，并通过显微注射方法，注射进已受精但没有活化的卵粒中，从 而得到转基因鱼。该转基因鱼具有明显加快的生长速率，最大的转基因鱼体重是 与转基因对照组平均体重的1 3 倍( d ue ta l ，1 9 9 2 ) 。随后，大量的相关报道陆续 问世，包括转垂体激素基因鱼的生理特性特性，如发现转g h 基因的鱼类与家养 的鱼类具有相似的性状：较高的代谢率，对脂质特别是甘油三酯的较高利用率 6 文献钙：述 ( k r a s n o ve ta l ，1 9 9 9 ) 等。 对于垂体激素基因的克隆完成之后，很重要的一部分工作便是对其基因的表 达、分布情况的研究，从而从另外的角度来研究激素或基因的功能。 虽然早在1 9 8 5 年，在结构上运用荧光技术观察到罗非鱼与荧光相连的神经 垂体分支深入到了r p d 中，揭示了生长激素释放抑制因子( s o m a t o s t a t i n ) 通过 一个怎样的途径传递到r p d 并抑制p r l 的释放( g r a ue ta l ，1 9 8 5 ) 。但在细胞核 分子水平上的研究却很少。直到进入2 1 世纪，生物技术不