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山东大学硕士学位论文 新异淀粉高产酵母菌株和异淀粉过量发酵生产 摘要 异淀粉( p u l l u l a n ) 是一种应用价值较高的微生物胞外多糖，除了异淀粉本 身在农业、食品工业、制药工业和化妆品工业中具有重要用途外，经过化学改 造的各种异淀粉衍生物还是很重要的抗病毒、抗血栓、抗血凝固、抗肿瘤药物的 工业原料。但由于现有工业化生产菌株其产量低，实际应用就受到了很大的限制。 根据国内外文献报道，现有的异淀粉的生产菌株主要是出芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) ，其产量一般在3 0 一5 o ( w v ) 左右，并且这一 菌株发酵产生胞外多糖时容易产生色素，给产品的后处理带来极大的不便，随着 发酵时间的进行，发酵液的p h 不断下降，从而影响了胞外多糖的产生。因此，获 得新特征和产量更高的异淀粉生产菌株和研究这些菌株发酵最佳条件的工作就 变得非常重要，这就是本研究主要的目的。 为了寻找可以产生大量胞外多糖的菌株，我们从法国南部城市t o u l o u s e 郊 区采集了十几种植物叶子，从这些叶子上分离到了i 0 0 多株酵母菌，并测定了它 们产胞外多糖的能力，其中一株酵母菌y 6 8 的胞外多糖产量最高，并且在发酵 过程中不产黑色素，发酵液p h 变化不大，生长迅速，合成胞外多糖的速率快， 糖转化率高，发酵周期短，所需培养基成分简单，所以我们对该菌株的胞外多 糖组分进行了分析，并且运用b i o l o g 技术以及酵母菌鉴定常规方法对y 6 8 进行 了菌种鉴定。得出结论为：y 6 8 属于r h o d o t o r u l a 9 a c 8 2 u m , 其所产生的胞外多 糖为异淀粉，这是首次报道r h o d o t o r u l ab a c a r u m 在发酵过程中可以产生大量 的异淀粉。 针对此菌株在发酵时的营养、初始p h 、接种量、温度和转速等条件的需求， 首先我们进行了摇瓶发酵条件的研究，发现菌株y 6 8 发酵产异淀粉的最适条件 为：最佳培养基配方为：8 0 ( w v ) 葡萄糖，2 0 ( w v ) 豆饼粉水解液， 0 5 ( w v ) k 2 h p 0 4 ，0 1 ( w v ) n a c l ，0 0 2 ( w v ) m g s 0 47 h o ：，0 0 6 ( w v ) ( n h 。) ：s o 。： 初始p h 7 0 ，接种量：接入种子液后发酵培养基的o d 。为0 2 - 0 8 。在上述条 件下，经过2 8 振荡( 1 8 0 r p m ) 培养6 0 小时，纯多糖产量可达5 9 1 7 ( w v ) 。 而后进行了上罐条件的摸索，罐体积为5 l ，上样量为2 5 l ，在上罐实验中，主 要进行的是转速，通气量以及最佳发酵时间等条件的研究。发现在5 l 发酵罐中 产胞外多糖的最佳条件为：上样量8 0 ( v v ) ，最佳转速3 0 0 r p m ，最佳通气量 为6 5 l m i n ，最佳发酵时间7 2 h 。在此条件下，得到的最高异淀粉产量为7 5 ( w v ) ，糖转化率高达9 3 以上。这是目前所有酵母中异淀粉产量最高的菌株。 关键词：r h o d o t o r u l ab a c a r u f a ，异淀粉( p u l l u l a n ) ，最适条件 山东大学硕士学位论文 o p t i m i z a t i o n o fm e d i u ma n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o r p u l l u l a np r o d u c t i o nb y an e w p u l l u l a n - p r o d u c i n gy e a s t s t r a i n a b s t r a c t p u l l u l a ni sa ne x t r a c e l l u l a rw a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e ，i t i so fe c o n o m i c i m p o r t a n c ew i t l li n c r e a s e da p p l i c a t i o n t ot h ea g r i c u l t u r ea n df o o d ，c h e m i c a l ，c o s m e t i c i n d u s t r i e s m o r e o v e r ，c h e m i c a l l ym o d i f i e dp u l l u l a n si so fi m p o r t a n c ea st h e yh a v e m a n ya p p l i c a t i o n s t oi n d u s t r i a lm a t e r i a l so fa n t i v i r u s ，a n t i t h r o m b u s ，a n t i b l o o d s o l i d i f i c a t i o na n da n t i t u m o u rm e d i c a t i o n b u ti t sa p p l i c a t i o nw a sa c t u a l l yl i m i t e dd u e t ot h el o w p r o d u c t i o ny i e l do f p u l l u l a n 。a c c o r d i n g t ot h er e p o r t st od a t e ，m o s ts t r a i n s p r o d u c i n gp u l l u l a n w e r ea u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ，w h i c hp r o d u c t i o ny i e l do f p u l l u l a n w a sa b o u t3 o - 5 o ( w v ) m o r e o v e r ，m e yp r o d u c e dm e l a n i nd u r i n gf e r m e n t a t i o n ， w h i c hm a d ei td i f f i c u l tt op u r i f y p ho ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t hd e c r e a s e dw i t ht h et i m e ， w h i c ha f f e c t e dt h ep r o d u c t i o no f e x o p o l y s a c c h a r i d e s s oi t w a si m p o r t a n tt of i n da n e w p u l l u l a n p r o d u c i n gy e a s ts t r a i n i no r d e rt of m ds t r a i n st h a tc o u l d p r o d u c e a g r e a td e a lo fe x o p o l y s a c c h a r i d e s ，m o r e t h a n1 0 0 y e a s ts t r a i n sw e r e i s o l a t e df r o mt h el e a v e si nt o u l o u s eo f t h es o u t ho f f r a n c e t h e i ra b i l i t yt op r o d u c ee x o p o l y s a c c h a r i d e sb yt h e mw a sd e t e c t e d s t r a i ny 6 8w i t h t h eh i 曲e s te x o p o l y s a e c h a r i d ep r o d u c t i o nw a sf u r t h e rs t u d i e d y 6 8d i 血tp r o d u c e m e l a n i nd u r i n gf e r m e n t a t i o n ，a n dt h ep no ff e r m e n t a t i o nb r o t hh a dn om u c hc h a n g e y 6 8g r e wf a s ta n dh a dh i 曲p r o d u c t i o nr a t eo f e x o p o l y s a c c h a r i d e s u g a ru t i l i z a t i o n m t cw a sh i g h ，a n di t sf e r m e n t a t i o np e r i o dw a ss h o r t t h ec o m p o s i t i o no fc u l t u r e m e d i u mf o rp r o d u c i n ge x o p o l y s a e c h a r i d e sw a ss i m p l e b e c a u s eo ft h e s ev i r t u e s ， e x o p o l y s a c c h a r i d e sc o m p o n e n t o fy 6 8w a sa n a l y z e da n dt h i ss t r a i nw a si d e n t i f i e db y b i o l o gs y s t e ma n d c o n v e n t i o n a ly e a s ti d e n t i f i c a t i o nm e t h o d st h er e s u l t ss h o w e dt h a t y 6 8w a sr h o d o t o r u l ab a c a r u ma n dt h ee x o p o l y s 卸e c h a r i d ep r o d u c e db yi t w a s p u l l u l a n t h i si st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h a tp u l l u l a nw a sp r o d u c e db y r h o d o t o r u l a 山东大学硕士学位论文 f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si n r o t a r ys h a k i n g f l a s k sw e r es t u d i e dt om e e tt h e r e q u i r e m e n to fc u l t u r e ，i m t i a lp h ，i n o c u l a t i o n ，a n dt e m p e r a t u r e ，a g i t a t i o nr a t e t h e o p t i m a lm e d i u m f o rp u l l u l a np r o d u c t i o n b yt h i ss t r a i nw a s8 o ( w v ) g l u c o s e ，2 o ( w v ) s o y b e a nc a k eh y d r o l y s a t e ，o 5 ( w v ) k 2 i - i p 0 4 ，o 1 ( w v ) n a c i ，0 0 2 ( w v ) m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 ，o 0 6 ( w v ) ( n h ) 2 s 0 4 , i n i t i a lo h7 0 ，a n dt h eo d 6 0 0 n mo ft h e f e r m e n t a t i o nb r o t hw a s0 2 0 8a f t e r b e i n g i n o c u l a t e d m a x i m u m p u l l u l a n p r o d u c t i o nw a sa t t a i n e d a t2 8 。ci ns h a k ef l a s k sa t 1 8 0 r p mi n6 0 h u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，5 9 2 ( w v ) p u u u l a nw a sa c h i e v e d t h e n t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si na s t i r r e dt a n kf e r m e n t o rw e r es t u d i e d f e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u ti na5lf e r m e n t o r 、析t i law o r k i n gv o l u m eo f2 5 l a g i t a t i o nr a t e s a e r a t i o nr a t ea n df e r m e n t a t i o nt i m e w e r ee x a m i n e d am a x i m u m p u l l u l a ny i e l do f7 5 ( w v ) a n dg l u c o s eu t i l i z a t i o no f 9 3 w e r ea c h i e v e da ta g i t a t i o nr a t eo f 3 0 0 r p ma n da e r a t i o nr a t eo f 6 5 l m i ni n7 2 h k e yw o r d s ：r h o d oc o r u l a6 a c a f u q ；p u l l u l a n ：s u i t a b l ec o n d i t i o n s 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：远壑拉日期：竺! ：生堡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：堑塾丛导师签名：盔型型b 期：! ! ：! ：! 二 山东大学硕士学位论文 新异淀粉高产酵母菌株和异淀粉过量发酵生产 一微生物胞外多糖的简单介绍 i 微生物胞外多糖的分类 前言 微生物多糖包括某些细菌、真菌和蓝藻类产生的多糖，主要以三种形式存在： 粘附在细胞表面上；分泌到培养基中；构成细胞的成分。微生物多糖，因其安全 无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多 糖和胞外多糖。微生物胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r o r i d e ) 是某些微生物在各种 碳源上生长过程中产生的，存在于发酵培养基中的可溶性多糖。胞外多糖由微生 物大量产生，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。按照胞外多糖来 源来分，微生物胞外多糖可以分为细菌多糖、真菌多糖、酵母菌多糖和藻类多糖。 细菌多糖中又分为黄单胞菌多糖、乳酸菌多糖、动胶菌多糖和固氮菌多糖。按照 胞外多糖的化学结构来分，微生物胞外多糖可以分为旺一1 ，6 一葡聚糖，如异淀粉、 b 一1 ，4 - 葡聚糖为主结构的，与三糖侧链通过a l 。3 键连接的黄原胶( x a n t h a n g u m ) 、含有p l ，3 一糖苷键和d 一1 ，6 - 糖苷键的硬葡聚糖( s c l e r o g l u c a n ) 、含有 p 一1 ，3 - d 一葡萄糖，d l ，4 - d 一葡萄糖酸，p 一1 ，3 一d 一葡萄糖，a l ，4 一l 一鼠李糖为重 复单位的吉兰糖胶( g e l l a ng u m ) 和含有硫酸基团的硫酸胞外多糖( s u l f a t e d e x o p o l y s a c c h a r i d e ) 。由黄单胞菌产生的黄原胶，由类酵母( y e a s t 一1 i k e ) a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s 产生的异淀粉( p u l l u l a n ) ，由丝状真菌s c l e r o t i u m “u c a n i c u m 产生的硬葡聚糖( s c l e r 0 9 1 u c a n ) 和细菌s p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s 产生的吉兰糖胶( g e l l a ng u m ) 己得到了大量研究，并且这些多糖得到大量生 产，已被广泛应用于食品、医药和石油工业中。而由真正酵母菌产生的胞外多 糖研究得非常少。据d e e v e l e i g h 统计，已经发现4 9 属7 6 种微生物产生胞外 多糖，但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随 山东大学硕士学位论文 着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增长量均在1 0 9 6 以 上，而一些新型多糖年增长量在3 0 以上。到目前为止，已大量投产的微生物胞 外多糖主要有黄原胶( x a n t h a ng u m ) 、结冷胶( g e l l a ng u m ) 、小核菌葡聚糖 ( s c l e e r o g l u c a n ) 、异淀粉( p u l l u l a n ) 、热凝多糖( c u r d l a n ) 【卜3 】等。微生 物多糖具有植物多糖不具备的优良性质，它们生产周期短，不受季节、地域和病 虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。目前，许多微生物多 糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、 化工等多个领域。据估计，全世界微生物多糖年加工业产值可达5 0 1 0 0 亿美元 1 4 1 。 2 微生物胞外多糖的用途 微生物胞外多糖是近2 0 年来陆续开发的发酵新产品，因其具有独特的物化 性质，已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂、悬浮剂和润滑剂等应 用于石油、化工、食品和制药等多个领域 5 1 。由微生物产生的胞外多糖在工业 上有许多重要的用途：1 ) 由于多糖具有粘合和结合作用，可以用于纸张、纸浆 和纺织产品中，可以加强纸张的强度或作为表面层物质使纸张表面更加光滑；在 建筑业方面可以作为建筑材料的粘合剂，这些多糖包括黄原胶；2 ) 由于多糖具 有载体作用，可以作为杀菌剂、肥料、杀真菌剂和杀虫剂的组分，起抗沉淀作用， 这些多糖包括黄原胶和葡聚糖；3 ) 由于微生物多糖具有络合作用，可以用于金 属回收、水的纯化和污染控制，这些多糖包括黄原胶；4 ) 由于多糖具有絮凝作 用，可以用于蛋白质沉淀或回收、工业上食品处理、废水处理和饮料的澄清，这 些多糖包括黄原胶、动胶菌葡聚糖、支链淀粉和其他微生物产生的多糖；5 ) 由 于多糖是一类分散剂，稳定剂和表面活性物质，可以用于化妆品和其他皮肤保健 剂中，同时在油漆、色素、药物、食品、墨水和显色剂中胞外多糖也有重要的 用途，这些多糖包括黄原胶等其他多糖；6 ) 由于多糖具有装饰作用，可以用于纺 织、纸张和纸浆产品和外壳附加物中，这些多糖包括黄原胶；7 ) 由于多糖具有 胶化剂的作用，可以用于食品、化妆品和药物中，并且在石油开采中多糖也有重 要的用途，这些多糖可以润滑油井、提高采油率和石油产量多糖还可以作为润滑 剂和清洗剂，用于管道的清洗，这些多糖包括黄原胶和硬葡聚糖；结冷胶( g e l l a n 2 山东大学硕士掌位论文 g u m ) 可以作为琼脂的替代品制备生物培养基，特别是可以用于澄清度要求高的 培养基，如嗜温微生物的培养基【6 】。结冷胶在园艺和农业中的使用前景也很广 阔【7 】，它被认为是植物组织培养的良好培养基；8 ) 由于多糖具有基质 ( m a x t r i x ) 作用，可以作为分离或层析的物质，作为食品或不断释放香味物质的 结构基质，与面粉等原料混合之后可以释放出香味物质，便于用于面包制作等。 作为固定化酶或细胞，生物医药或外科物质的结构基质，这些多糖包括黄原胶、 葡聚糖和其他微生物多糖；9 ) 由于这些多糖可以在某些表面上成为薄膜层，并 且无毒无害，可以作为分离过滤物质，作为食品和药物的包装和保护膜，这些多 糖包括黄原胶、异淀粉和其他微生物多糖；1 0 ) 由于含有b l ，3 一糖苷键和 b 一1 ，6 - 糖苷键的可溶性微生物多糖具有提高巨噬细胞和t 细胞的数量和功能而 具有抗癌活力，增加人体抗微生物疾病的能力和提高人体免疫能力，可以作为抗 癌药物和免疫促进剂，这些多糖包括硬葡聚糖和g r i f o l af r o n d o s a 产生的具有 b l ，3 - 葡聚糖结构的奇果葡聚糖n m f 一5 ( g r i f o l a nn m f 一5 ) 。分子量大并且在 p 一1 ，3 葡聚糖主链中存在有d 一1 ，6 - d - 葡萄糖苷残基作为侧链对于提高免疫活力 是非常关键的。如果对这些含有b 一1 ，3 - 糖苷键的胞外多糖侧链葡萄糖残基进行 结构修饰，可以进一步提高它们的抗癌活力。能产生d 一葡聚糖的微生物包括许 多真菌，产生的b 一葡聚糖有胞内的和胞外的，尤其是担子菌纲的丝状真菌产生 的d 一葡聚糖是胞内。目前对这些p 一葡聚糖引起的抗癌活力机制还没有完全弄清 楚：1 1 ) 硫酸多糖由于多糖分子链上含有多聚阴离子，可以与病毒粒子表面上的 阳离子结合或者与病毒寄主细胞表面的阳离子结合，从而阻止了病毒感染细胞。 其他一些硫酸多糖可以选择性地抑制h i v 病毒的反转录酶，从而抑制了病毒在细 胞中的复制。某些天然和人工合成的硫酸多糖可以诱导机体产生干扰素，还有一 些硫酸多糖可以刺激肿瘤死亡。从某些海洋藻类细胞中获得的硫酸多糖还是很好 的抗氧化剂。 3 微生物胞外多糖国内外研究进展 ( 1 ) 目前国内外对微生物胞外多糖的研究现状 某些植物和海洋藻类也可以产生多糖类物质，如海藻酸、卡拉胶和琼脂等， 但是这些植物和海洋藻类的来源受季节和资源的限制，而利用微生物生产胞外多 u 山东太学硕士学位论文 糖则不受季节限制，可以利用发酵罐在人工控制条件下进行发酵生产。 工业规模生产异淀粉的公司有日本的h a y a s h i b a r a 生化公司。世界上生产 黄原胶的公司很多，每年黄原胶的产量达到i 0 ，0 0 0 - 2 0 ，0 0 0 吨。硬葡聚糖首先 在1 9 7 9 年由m i n n e a p o l i s 的p i l l s b u r y 公司用于商业化生产，所用的商品名称 是p o l y t r a n 。1 9 9 2 年s a n o f i eb i oi n d u s t r i e ss a 公司从s a t i a 中获得生 产权。最近( 1 9 9 3 年) 吉兰糖胶由k e l c o 公司应用于商业化生产。 目前发酵生产的异淀粉最高产量是2 2 9 ( w v ) ，转化效率是7 6 3 ；黄原 胶的最高产量是2 7 ( w v ) ，转化效率是9 0 ，生产力是0 7 4 k g m 3 h ：发酵结 束后吉兰糖胶最终浓度是1 2 5 ( w v ) ，最高生产力是0 2 1k g m 3 h = 目前发酵 生产的硬葡聚糖最高产量不超过1 5 ( w v ) 。而其他微生物胞外多糖的产量要 比上述几种的产量低得多。 目前基本上是利用天然菌株通过优化发酵工艺和发酵培养基来生产微生物 胞外多糖。对于微生物合成胞外多糖的机理主要是研究了黄单胞菌合成多糖的基 本过程、代谢调控和与合成多糖有关的基因等。对于真核微生物合成胞外多糖的 生化过程和代谢调控知道得非常少，对于真核微生物合成胞外多糖的基因更是一 无所知。对于工业生产来说，了解胞外多糖的合成和分泌过程、代谢调控和有关 的基因，有利于从生化机理和遗传基因水平上进一步提高胞外多糖的产量和从体 内代谢水平上对多糖结构进行生化修饰。 生产微生物胞外多糖的主要方法是分批发酵，也有用分批补料的方法来提高 产量。目前基本上是利用天然菌株通过优化发酵工艺和发酵培养基来生产微生物 胞外多糖，优化对象包括弄清合适的c n 比值，某些无机盐对产胞外多糖的影响， 最适的发酵温度、p h 、通氧量等。 我国和日本许多研究人员也试图从食用真菌细胞中提取b 一葡聚糖，作为抗 癌药物和免疫促进剂，但是这种生产方法工艺太复杂，多糖产量低，难以大 规模生产。 ( 2 ) 目前微生物胞外多糖生产方法的优缺点 就像上面所介绍的那样，目前工业规模生产微生物胞外多糖的微生物主要是 细菌和丝状真菌，不同种微生物生产的多糖结构各不相同，性能也各异，但在食 山东大学硕士学位论文 i 品、化工和医药等方面都有广泛的用途，这些生产方法避免了受季节和资源限制 等问题，多糖产量比较高，产品易于提取和精制。但是，目前这些生产方法也存 在许多缺点，比如利用细菌生产多糖时所用的黄单胞菌是绝对需氧的微生物，在 发酵的后期，由于多糖在培养基中大量累积，培养基粘度增大，对于氧气在培养 基中的传递造成了很大问题，影响了多糖的产量和多糖应有的化学性质，如多糖 分子的长度等，还有就是细菌的安全性和对人体健康的影响也是消费者非常关注 的问题。利用丝状真菌生产多糖其产物高粘度的问题对发酵产量也会产生许多不 利的影响，丝状真菌在液体中通过振荡或搅拌培养时菌丝都会产生球状体，这对 于氧气和底物与细胞的接触和细胞对这些物质的吸收以及发酵产物的排出都会 造成非常不利的影响，最终影响多糖的产量和多糖的物理化学性质，同时还会影 响粘稠发酵培养基的混合。目前这些细菌和丝状真菌产生的胞外多糖产量相对比 较低，发酵过程难以控制，这些与它们的发酵生理( 绝对需氧) 和菌丝生长成球状 体有密切的关系。 二异淀粉( p u l l u l a n ) 的研究情况 异淀粉( p u l l u l a n ) ，又称为普鲁兰糖，是一种应用价值较高的微生物胞外多 糖 8 1 ，它是线状n d 葡聚糖，主要由麦芽三糖单位通过a l ，6 糖苷键互 相连接而成【9 】。q 一1 ，4 和a 一1 ，6 键二者之间规则交替使得普鲁蓝糖有 两个重要的特性：结构上富有弹性，溶解度比较大【l o l 。在浓度较低的情况下， 普鲁蓝糖溶液的粘度却较高，因此它可以用来做氧不通透性保护膜、增厚剂、粘 胶等【1 1 】。尽管普鲁蓝糖有这些优点，但由于其产量低，实际应用就受到了很 大的限制。根据国内外文献报导，现有的普鲁蓝糖生产菌株主要是出芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) ，其多糖的产量一般在3 0 5 0 9 l 左右。而且这一 菌株发酵产生胞外多糖时易产生色素，给产品的后处理带来极大的不便，且随着 发酵时间的进行，发酵液的p h 不断下降，从而影响胞外多糖的产生【1 2 1 。因此， 研究普鲁蓝糖的生产菌株和发酵条件的工作就变得非常重要。普鲁兰多糖的研 究工作起始于西德，英国人在理论方面也做了不少工作。日本进行了比较系统尤 其是生产工艺和产品应用的研究，并取得大量专利【1 3 1 。普鲁兰多糖可由淀粉 水解物。蔗糖或其他糖类直接发酵生产，易溶于水，粘度较低，不凝胶化，不老 山东大学硕士学位论文 化，可任意加工成型，无毒副作用，是一种很有前途的工业用多糖。 1 异淀粉产生菌种 现有的异淀粉生产菌株是出芽短梗霉( a u r e o b a c i d i u m p u l u l a n s ) 。异淀粉 根据英文名字在国内也有人译作为普鲁兰糖，是由爿p “u a ，7 s 从葡萄糖、果 糖、木糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖或蔗糖在含有无机盐的发 酵液中生成的【1 4 ，1 5 ，1 6 。异淀粉是出芽短梗霉在培养液中生长、代谢产生的 细胞外多糖。培养液中一部分糖作为营养源用于生长繁殖，大部分被胞内复杂的 酶系作用生成异淀粉。糖用尽后，异淀粉则被分解，维持细胞的发育【1 3 】。因 为异淀粉( 普鲁兰多糖) 有广泛用途，我国科研工作者近年来也对其生产菌株进行 了大量的开发研究工作。谈家林等对a s 3 2 7 6 5 的变异株n 2 8 进行发酵条件及中 型扩大实验【1 7 】。谷才思和杜立生【1 8 也分别从广西桂林马尾松针叶和海水 中分离到产胞外多耱的短梗霉。那淑敏【1 8 】从加拿大切蜂虫茧上分离到了产无 色胞外多糖的菌株a 2 2 ，其按照h e r m a n i d e s n i j h o f 分类系统，与出芽短梗霉普 鲁兰变种( a u r e o b a s i d u m p u l l u l a n sa i l l v a r p u l l u l a n s ) 相似。赵之伟等【1 9 从昆明西山生长的地石榴叶片上分离到一株野生型出芽短梗霉f t 。，从f t 。出发 经原生质体再生获得一株性状稳定，具有一定工业价值的变异菌株r 4 5 。 除以上所述外，能够生产异淀粉的出芽短梗霉还有很多种，它们形态特征生 理变化差异较大，生产异淀粉的能力也不相同，广谱普鲁兰多糖性能优良的菌株 通常具有酵母型及菌丝型形态特征，出芽孢子多而均匀，发酵液中黑色素少或不 形成，发酵后处理工序简单等特点。 2 异淀粉的发酵工艺的影响因素及产量测定 目前已有不同规格的普鲁兰多耱产品，但并没有大规模地投入生产。大部分 菌株尚处于实验室研究阶段。不同的出芽短梗霉的发酵条件是不同的。但研究发 现，碳源、氮源、金属离子、起始离子及磷酸盐的选择均影响发酵生产转化普鲁 兰多糖。食用淀粉作为碳源比工业淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖等产糖效率更高。 各种铵盐如( n h ，) ：s o 。，n h ，c 1 和( nh ，) ：c o 。都可以作为氮源使短梗霉生长， 但铵盐的用量对糖的转化率有影响，n h 4 + 的最佳作用浓度0 0 2 。k + 和p 0 一能促 6 山东大学硕士学位论文 进普鲁兰多糖的产生，其中k + 的最佳作用浓度范围是0 0 2 一0 0 4 ，超过0 0 4 会抑制普鲁兰多糖的产生。发酵的最佳起始p h 为6 左右。一般产普鲁兰多糖的 最适培养温度在2 8 c 左右【2 0 】。 3 异淀粉的性质 异淀粉( 普鲁兰多糖) 是无色、无味无臭的高分子物质，性质可以表现于以 下几个方面【1 7 】。 3 1 无毒性，安全性 无论是急性，亚急性和慢性试验，变异源性试验都表明，普鲁兰多糖不引起 任何生物学毒性和异常状态，用于食品和医药工业安全可靠。 3 2 耐热性 粉末状普鲁兰多糖对热的反应与淀粉相同。与其它高分子材料不同，它的炭 化不产生有毒的气体。 3 3 耐盐性 任何浓度的盐分含量均不影响普鲁兰多糖溶液的粘度。因此，用作食品添加 剂时不因食盐的存在而起变化。 3 4 耐酸碱性 普鲁兰多糖是中性多糖，其粘度在常温下受p h3 以下水解则粘度降低。 3 5 粘度 普鲁兰多糖是线形状结构，因此它的粘度远低于其它多糖，普鲁兰多糖溶液 粘度随平均分子量增加而增加，也随浓度增大而增大。但比起其它高分子物质的 粘度增加要小。并且它的粘度热稳定性较好。 3 6 可塑性 普鲁兰多糖的可塑性强，可以用来制膜，任意造型。它的成型物不需要添加 增塑性和稳定性。 3 7 薄膜性质 普鲁兰多糖直接制成薄膜，或在物体表面涂抹或喷雾涂层均可成为紧贴物体 的薄膜，普鲁兰多糖薄膜的最特殊的性质是比其它高分子薄膜的透气性能低，氧、 氮、二氧化碳等几乎完全不能通过。薄膜还具有较大的透湿性。5 o 的普鲁兰多 糖和5 o 的甘油形成的膜具有较高的阻气性和拉伸强度【2 1 】。 正是因为普鲁兰多糖具有以上性能，它能够广泛用于医药制造，食品包装，水 果和海产品保鲜，化妆品工业，烟草制造工业和农业种子保护等众多领域，是一种 有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品【8 ，2 2 ，2 3 ，2 4 1 。下面我们具体介绍 一下普鲁兰糖在农产品保鲜方面的应用。 4 异淀粉在农产品保鲜方面的应用1 2 5 1 4 1 苹果和柑橘 苹果和柑橘类水果不耐存放，易腐烂，常用的冷藏方法效果并不理想。普鲁 兰多糖本身无毒、无臭，对人体无任何副作用，作为果实的保鲜是很理想的。它 能克服过去用的涂层剂如丙烯醇、溶剂型腊、天然腊和聚乙烯包装的缺点，这些 涂层剂虽然能使果实内氧气含量降低、碳酸气增高，但也诱发发酵，积累乙醇和 醛，产生恶臭。 用普鲁兰多糖和其它涂层剂浸泡徐州蜜柑，在1 0 c 储存7 4 日，普鲁兰糖除 了不影响果实成分外，在引起果实腐烂、黑斑和失重等方面其影响也是最低的。 用普鲁兰多糖处理苹果试验，分别用不同( 5 ，1 0 ，2 0 万) 分子量的普鲁 兰多糖以1 浓度浸泡苹果5 m i n ，自然晾干，包装入o c 库储藏，结果发现不同 分子量的普鲁兰多糖都有较好的保水作用，尤其以高分子量的普鲁兰多糖效果更 好。用1 0 万分子量不同浓度( o 5 、1 - 0 9 6 、1 5 、2 o ) 的普鲁兰多糖试剂 处理苹果时，各种浓度保水作用无明显差异，随浓度增加，保水作用增强，浓度 1 o 以上就具有很好的保水作用。 研究还发现，普鲁兰本身不具有杀菌、抑菌作用，而多灵菌、扑海因和特克 多具有良好的杀菌、防病毒侵染和防腐防病作用。这些杀虫剂1 0 0 0 “( 常用有效 浓度) 和1 普鲁兰多糖混合处理水果，防腐效果更明显，原因是普鲁兰多糖具 有良好的成膜性。杀虫剂涂于果实表面，普鲁兰多糖起到隔绝氧气、延缓杀菌剂 分解和延长药效的作用。 普鲁兰多糖处理果实对货架期的影响更明显。用普鲁兰多糖和杀虫剂混合使 用后，对果实货架期质量保持，减少水分损失，延长货架期具有明显效果。 4 2 鸡蛋 山东大学硕士学位论文 鸡蛋在冷藏条件不足时，多在蛋壳表面涂石蜡或液体石蜡保藏，但效果不理 想，普鲁兰多糖或其酯化物用于鸡蛋涂层材料，在室温下可延长保存期，增强蛋 壳硬度，减少碰撞破损。普鲁兰多糖可食用，冷温水易洗去。若用普鲁兰多糖浸 渍或喷雾，能在蛋壳表面形成附着牢、表面光洁的薄膜层。膜厚0 0 1 0 1 m m ， 可增大蛋壳的硬度，阻止局部受压引起破裂，阻止细菌侵入及氧、二氧化碳、水 蒸汽的流通，延缓蛋白和蛋黄变质。 用普鲁兰多糖或其衍生物涂层，单独使用或混合其它物质使用效果都好。 普鲁兰多糖和其它疏水性物质、天然胶配制成均匀稳定的乳化剂，也是有效 的涂层材料，耐水性更高，例如用普鲁兰多糖、阿拉伯胶、椰子油和水的混合液 涂新鲜鸡蛋，在3 0 。c 和4 0 相对湿度条件下保存，结果蛋壳表面光亮，外观同新 鲜鸡蛋。单独使用油脂或含油比例高的乳化剂涂层，油脂将透入蛋壳内。 普鲁兰多糖、阿拉伯胶、虫胶、椰子油混合成的乳剂涂于鸡蛋外，在1 5 2 5 c 保存，可食期比不处理的对照延长5 1 0 倍。配方中添加虫胶可增加耐水性。 4 3 蔬菜、干果 疏水性物质( 石蜡、油脂、高级脂肪酸、高级醇) 1 0 0 份，水4 0 一1 4 0 份， 表面剂0 0 1 5 - 5 0 份，水溶性高分子物质( 普鲁兰多糖、阿拉伯胶、藻酸钠等) 0 。0 1 5 - 5 0 份组成的乳液，作保鲜蔬菜涂层，保鲜效果十分显著。例如，带英蚕 豆在2 5 ，2 3 天变黑色，涂层后1 4 天，仍保持绿色，保存期延长5 倍。绿色 芦笋在2 5 ，2 3 天变萎缩，不能出售，而涂层2 0 天后仍无改变，保存了商品 价值。 将生菠菜切成适当大小，喷以3 的普鲁兰多糖溶液，冷冻干燥，用防潮袋封 存5 个月，颜色和香味变化小，维生素只减少1 0 普鲁兰多糖丙酸酯( 取代值0 5 ) 的溶液喷于切断了的菠菜或其它蔬菜上，冷冻干燥，不用防潮袋保存5 个月【2 6 】， 颜色和形状变化小，烹调后仍保持新鲜风味。 冷冻干燥的青菜，涂层同样起到防止氧化、保色、保香的效果。 油脂类含量高的果实如花生、核桃、杏仁、豆类、干鱼贝类，干燥的整薯条、 萝h 类，表面喷涂极薄的普鲁兰多糖膜能有效防止氧化作用 2 1 】。 以上介绍了普鲁兰多糖在农产品保鲜方面的作用。除此之外，普鲁兰多糖在 食品的保存，做低热量主食，点心或饮料原料以及食品品质改良，食品成型方面 山东大学硕士学位论文 均有显著效果。 三利用酵母菌生产胞外多糖的优点及其应用前景 酵母菌在食品、发酵和药品工业中使用已有几千年的历史，是世界上公认的 最安全的微生物，这类真核微生物细胞本身不含有任何毒素，在代谢过程中也不 产生任何毒素，相反，细胞本身含有各种维生素，营养十分丰富，直接食用酵母 菌细胞可以给人体补充许多营养成分。多数酵母菌为单细胞微生物，通过芽殖或 裂殖进行生长繁殖，它们可以在有氧条件下进行有氧呼吸进行生长，也可以在无 氧条件下通过发酵进行生长。在生长过程中可以利用多种碳源，如葡萄糖、蔗糖、 果糖、麦芽糖和糊精进行代谢和生长，有许多酵母甚至可以利用淀粉、菊糖、果 胶和半纤维素等可再生物质作为碳源。在利用这些碳源过程中可以产生许多有用 的发酵产物。所需的营养比较简单，有许多工农业的副产品经过适当处理便可以 作为它们的营养物，发酵过程比较容易控制。某些酵母菌可以发酵多种碳源产生 大量的胞外多糖，不同种的酵母菌可以产生不同化学结构和生物活性的胞外多 糖，所有这些酵母菌特征对于发酵生产胞外多糖都是非常有利的，可以克服利用 细菌和丝状真菌发酵生产胞外多糖的许多不足之处。 四本研究工作的主要内容 本论文的研究内容就是在现有工作基础上，对菌株y 6 8 进行更具体的分类鉴 定工作，把它确定到种，并且对其所产生的胞外多糖的化学结构进行鉴定和分析， 最后对其产胞外多糖的条件进行优化实验，包括最适c n 比值、某些无机盐对产 胞外多糖的影响、最佳p h 、最适温度等，在此基础上，利用5 l 发酵罐进一步优 化发酵培养基和发酵工艺，找出最佳的发酵条件，使发酵液中的胞外多糖产量达 到6 0 ( w v ) 左右。 o 山东大学硕士学位论文 第一部分菌株y 6 8 的胞外多糖组分分析及菌种鉴定 为了寻找可以产生大量胞外多糖的菌株，我们从法国南部城市t o u l o u s e 郊 区采集了十几种植物叶子，从这些叶子上分离到了1 0 0 多株酵母菌，并测定了它 们产胞外多糖的能力，其中一株酵母菌y 6 8 的胞外多糖产量最高，并且在发酵 过程中不产黑色素，发酵液p h 变化不大，发酵周期短，所需培养基成分简单， 所以我们对该菌株的胞外多糖组分进行了分析，并且运用b i o l o g 技术以及酵母 菌鉴定常规方法【2 7 】对y 6 8 进行了菌种鉴定工作。 1 材料与方法 1 1 菌株 分离自法国树叶上的y 6 8 号菌株 1 2 培养基 1 2 1 菌种鉴定所用的培养基成分均按照参考文献 2 7 】来配制 1 2 2 y p d 培养基：1 o ( v v ) 酵母粉，2 0 ( w v ) 蛋白胨，2 0 ( w v ) 葡萄糖， 自然p h 1 2 3 豆饼粉水解液：3 2 9 豆饼粉，加入0 2 5 n 的盐酸2 5 0 m l ，1 5 磅水解3 0 m i n 后，冷却至常温，用0 2 5 n 的n 瑚中和至p h 约为5 5 - 6 5 之间，8 0 0 0 r p m 离心 5 m i n ，收集上清夜，沉淀用蒸馏水洗涤一遍，收集上清夜，沉淀丢弃。将上清夜 定容至8 0 0 m l ，即得到4 0 ( w v ) 的豆饼粉水解液。 1 2 4 种子液培养基：2 o ( w v ) 葡萄糖，1 0 ( w v ) 豆饼粉水解液， 0 5 ( w v ) k , h p o 。0 1 ( w v ) n a c l 。0 0 2 ( w v ) m g s 仉7 h o ：，0 0 6 ( w v ) ( n h 。) ：s 0 4 ， 初始p h 6 5 ，8 磅灭菌2 0 m i n 。 1 2 5 发酵培养基【2 8 】：6 0 9 6 ( w v ) 葡萄糖，1 0 ( w v ) 豆饼粉水解液， 0 5 ( w v ) k 2 h p o 。，0 1 ( w v ) n a c l ，0 0 2 ( v v ) m g s 仉7 h o 。，0 0 6 ( v v ) ( n h 。) ：s o , ， 初始p h6 5 ，8 磅灭菌2 0 m i n 。葡萄糖需单独灭菌，8 磅2 0 m i n ，然后在无菌条 山东大学硕士学位论文 件下将其加到培养基中。 1 3 培养条件 1 3 1 斜面培养：y p d 培养基，2 8 ，培养4 8 h 1 3 2 种子液培养：从斜面菌种上刮取2 环菌体，接种于装有5 0 m 1 种子液培养 基的3 0 0 m l 三角瓶中，摇床振荡培养，2 8 c ，1 8 0 r p m ，培养2 4 h 。 l _ 3 3 摇瓶