肠菌紊乱控制卒中后的神经炎症反应PPT课件.pptx

肠菌紊乱控制卒中后的神经炎症反应,1,.,目的:,急性脑缺血导致局部神经炎症反应，同时改变了外周免疫稳态；肠道菌群通过调整免疫稳态在自身免疫性疾病中起了关键作用；本实验探索急性脑缺血、肠菌改变、脑损伤后的免疫反应三者之间的机制通路,2,实验思路：,不同程度卒中对肠道菌群的影响研究卒中导致肠菌紊乱的机制（实验一）卒中后肠菌紊乱是否对卒中结局有其功能性影响检测周围活化的或极化的T细胞能在卒中后迁移入受损的脑组织（实验二）假设卒中后肠菌紊乱是调整卒中后系统免疫反应的关键靶器官。因此，采用粪菌移植FMT方法作为一种治疗方法恢复卒中后动物的健康肠菌，改善卒中结局。（实验三),3,实验一：,目的：研究卒中对肠菌的影响及机制：设计：通过两种不同程度的卒中（重度卒中fMCAo/轻度卒中cMCAo）造模，术后3天检测小鼠肠道功能和肠菌改变。结果：重度卒中模型(fMCAo)会影响肠道功能及肠菌结构，轻度卒中(cMCAo)造模不会明显影响肠道功能及肠菌结构。,4,实验一：图1：重度卒中fMCAo导致肠菌紊乱,a：甲酚紫染色fMCAo造模（3天后）的脑缺血梗死区域b:sham/fMCAo术前术后肠道菌群PC图；c：a多样性比较：fMCAo术后肠菌多样性降低（与术前相比）,5,实验一结果：图1：重度卒中fMCAo导致肠菌紊乱,d:多基因树展示fMCAo术后肠菌与术前、空白对照组三种最丰富菌（放线菌、拟杆菌、厚壁菌）的分布图，红色菌属的为术后明显改变。e:LEFSe（线性判别影响面积）算术分析：fMCAo术后特征性菌属差异。（单独放大图）,6,实验一：图2：fMCAo重度卒中导致肠道功能紊乱：肠动力受损检测,a：肠动力受损检测：fMCAo术后小鼠肠道可见：上段肠道荧光剂储留，表明胃肠动力受损严重（箭头示盲肠）b:肠道片段的荧光剂密度定量分析c：fMCAo、sham术后小鼠肠菌培养聚集群落数,7,实验一结果：图2：fMCAo重度卒中导致肠道功能紊乱：肠屏障受损检测,d:小鼠盲肠横截面没有发现肠菌侵入到固有层。e:酶免疫分析白蛋白浓度作为sham/fMCAO术后粪便/血浆比值。（评估肠屏障受损）,8,实验一结果：图2：fMCAo重度卒中引起应激；cMCAo轻度卒中不影响肠菌及肠道功能,f：血浆儿茶酚胺水平，fMCAo术后24小时明显升高。,g：cMCAo术后3天脑梗死区域h：cSham/cMCAo/fMCAo三组肠菌比较，左图为PC图，右图a多样性表明cMCAo术后不影响肠菌。i:cMCAo/cSham术后胃肠动力检测：无明显差异,9,实验二：,目的：研究fMCAo卒中后紊乱肠菌对卒中结局的作用及相关神经炎症通路设计：GF小鼠移植fMCAo后紊乱肠菌（3天），选择cMCAo轻度卒中造模（不影响肠菌），术后检测中枢和周围T细胞极化(Th1/Th17细胞）、脑梗体积；肠道淋巴结注射细胞跟踪实验观察肠道T细胞迁移入脑现象。结果：fMCAo卒中后紊乱肠菌导致炎症前体细胞Th1/Th17细胞反应，加重脑梗损伤。,10,实验二：图3：fMCAo卒中后紊乱肠菌移植实验设计,a:实验设计：无菌小鼠接种sham/fMCAo后菌群，3天后行cMCAo造模，5天后处死进行后续研究；b：肠菌PC图：sham/fMCAo术后供菌菌群、无菌小鼠接种后两组菌群明显区分,11,实验二：图3：移植fMCAo卒中后紊乱肠菌导致卒中结局加重,c：cMCAo术后5天，两组小鼠脑梗体积比较：移植fMCAo小鼠脑梗体积明显升高d：小鼠前爪使用率及竖起活性（圆筒实验检测小鼠竖立站起时单肢碰触）：移植fMCAo小鼠明显下降,12,实验二：图3：移植fMCAo卒中后紊乱肠菌导致中枢和周围T细胞极化异常,e：同测/对侧脑梗组织中IL-17/IFN-r/Foxp3表达：移植fMCAo小鼠脑梗区Th17(IL-17)/Th1(IFN-r）明显升高f:Payers淋巴结中Th17/Th1细胞点分布,13,实验二结果：图4：紊乱肠菌致卒中后观察肠道淋巴细胞入脑实验设计,a：实验设计：cMCAo/sham:CSFE/CM-Dil术后2d注入PP，24h后脑和淋巴器官取出，染料阳性T细胞检测。b：PP微注射T细胞标志染料后3h确定特定地点T细胞分布：PP来源的T细胞不出现在血液和脾脏中。,14,实验二结果：图4：紊乱肠菌致卒中后脑梗区来自肠道的不同极化T细胞表达,c：所有可检测到的PP中注射CFSE后24h,通过流式细胞术分析梗死区脑组织匀浆中CFSE标记的CD45+CD3+T细胞直方图。d：流式定量分析：cMCAo和sham比较：术后3天梗死区CFSE+总T细胞（左图：CD3+），T辅助细胞（右图：CD4+），手术组均升高。e：cMCAo术后3天和PP注射染剂24h后，脑梗死区CFSE标记的CD3+、CD4+T细胞百分比。f:脑侵入来自PP的CM-Dil+T细胞检测：在脑梗周围发现。g:累积图：定量CM-Dil-/CM-Dil+T细胞（CD3+)，每张脑梗组织切片累积而成。,15,实验三：,目的：通过粪菌移植FMT改善卒中后肠道菌群，从而改善卒中结局。设计：给fMCAo重度卒中后的小鼠移植健康小鼠粪菌，检测FMT治疗后小鼠肠菌改善、卒中结局及中枢及周围T细胞极化状态。结果：FMT治疗显著改善卒中后紊乱菌群，提高脑保护T细胞表达，减少脑梗体积，改善脑梗预后。,16,实验三：图5：粪菌移植(FMT)降低卒中后脑梗体积，提高脑保护细胞表达。,a:FMT-treat/sham-fMCAo/fMCAo三组间脑梗体积比较：FMT-treat组明显减小脑梗体积。b：流式细胞学结果：fMCAo术后3天，FMT-treat组Foxp3+Treg细胞在脾脏、梗死脑区的增加。c：Rag-/-（淋巴细胞缺陷）小鼠：FMT-treat没有a的结果,17,实验三：图5：粪菌移植(FMT)改善卒中后紊乱肠菌,d：FMT-treat稳态了fMCAo术后紊乱的肠道菌群：使厚壁菌、拟杆菌数量正常化e：shannon多样性指数分析a多样性：FMT-treat改善fMCAo术后降低的菌属f:多基因树：FMT-treat和安慰组小鼠术后3天的比较,18,结论：,1，卒中导致肠菌紊乱，紊乱的肠菌通过免疫介导的机制影响卒中结局；2，移植卒中后紊乱肠菌可加重卒中损伤和神经功能缺损；3，紊乱肠菌在小鼠身上种植后可导致炎症前体T细胞在肠道免疫区及受损脑区域中的极化现象；4，通过体内细胞跟踪，阐明肠道淋巴细胞迁移入受损脑区域的现象；