香蕉乙醇脱氢酶基因的克隆及其表达分析-硕士论文

I s o l a t i o na n dE x p r e s s l o na n a l y s l S 一 V o fa l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( A D H g e n ef r o mB a n a n a ( M u s as p p ) 彳劢e s i s S u b m i t t e di nP a r t i a lF u lf i l l m e n to ft h eR e q u i r e m e n t F o rt h eM a s t e rD e g r e ei nC r o pG e n e t i c sa n dB r e e d i n g B y W a n g s h a o h u a P o s t g r a d u a t eP r o g r a m S u p e r v i s o r ：J i nZ h i q i a n g C o l l e g eo fA g r i c a l t u r e A c a d e m i cT i t l e ：P r of e s s o r H a i n a nU n i v e r s i t y S i g n a t u r e A p p r o v e d J U l l e 2 0 1 0 劬7 ( 一 _4 名 。 ， 一， 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明l 、 原创性声明 本人郑重卢明：所寸交的学何沦义，是本人以：! 铷I i f 门指! 乒卜独矗：进i j ：埘究I ：作所取 得的成果。除文中已经注明引川的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人平| l 集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 敝? 酬j 彳 j 期：谚年6 月文日 学位论文版权使用授权说明 本人完全r 解海南人学犬丁收集、保存、使川学f 睑文的觇定，即：。学校有权保留斤向 国家有关部J 或机构送交论文的复印件利电子版，允许沦文彼在阅利借阅。本人授权海南人 学I 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有火数据库进行检索，可以采川影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学何论文。本人住导师指L ，- r - ) l 、完成的论文成果，知识产权p1 属海 南人学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者虢跏罕 日期：夕眵l oq - 6 月7 日 导师签名： l fj j ：矿加年6 月JH 本人已经认真阅凄“C A LL S 高校学f 一论文个文致辑! 席发桕尊群”，刚意将本人的学侮论 文提交“C A LL S 高校学位沦文全文数据悖”叶l 令戈发响J ，” 权麓。回重睑塞逞窒丘登压! 笪：匕生j ：笙；型：蕉鱼。 论文作者签名：2 沙形 日 5 】：) ，妒年易月 ，按“章群”中撅! 定享受相天 导师签名 - 乙 I t ! J ：| ：泖年61 t a I H 摘要 香蕉是世界上最重要的水果之一，被联合国粮农组织确定为世界第四大粮食作物。 在香蕉生长发育过程许多逆境，如涝害，低温等都会影响都香蕉苗的生长发育，从而影 响了香蕉果实的产量；香蕉果实是一种典型的呼吸跃变型果实，其采后成熟过程关系着 香蕉果实的品质和货架期的长短。乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，A D H ，E C 1 1 1 1 ) 广泛分布于各类植物器官组织中，与植物逆境生理、植株生长发育、果实采后成熟衰老 和芳香物质的生物合成等过程密切相关。因此研究乙醇脱氢酶和香蕉幼苗的逆境生长以 及香蕉果实的采后成熟之间的关系，为我们培育更加具有抗逆性的香蕉品种以及发展改 良创新采后保鲜和催熟技术具有重要意义。 本实验室于2 0 0 3 年采用抑制差减杂交的方法在香蕉采后成熟早期差异表达的低丰 度e D N A 序列，获得2 8 9 个克隆。B l a s t X 显示，有一个5 0 0 b p 的片段和其他植物的A D H 基因相似性很高，为此我们设计兼并引物对A D H 基因进行全长扩增，P C R 电泳结果发 现有两条很特异的带，测序结果表明，他们都属于A D H 家族，分别命名为M a A D H l 和M a A D H 2 。在此基础上，我们采用R A C E 技术从香蕉果实e D N A 文库中分离获得 M a A D H 2e D N A 全长，经序列测定和同源性分析表明，该e D N A 全长为1 1 4 0 b p ，含完 整的开放阅读框，编码3 7 9 个氨基酸残基，B l a s t X 分析表明，该e D N A 推导的氨基酸 序列与拟南芥、蓖麻、水稻有较高的一致性，( 9 2 、9 2 、9 1 ) 。保守结构域分析表 明，M a A D H 2 含有A D H Ns u p e r f a m i l y 和N A D B R O s s m a n ns u p e r f a m i l y 两个保守结构位 点，这与典型的A D H 基因的结构域相符。采用R T - P C R 的方法对其在香蕉各器官的表 达情况分析表明，该基因在香蕉的根、茎、叶、花、果实中均有表达。其中，茎、叶、 花、果的表达量较低并且差异不明显，根中的表达量较高。所以，M a A D H 2 可能在香 蕉不同的生长发育中起作用。 为研究M a A D H 2 与香蕉采后乙烯生物合成的关系，在正常成熟、乙烯诱导成熟和 1 - M C P 抑制成熟的条件下，测定了香蕉果实采后不同阶段的乙烯释放量并采用荧光定 量P C R 的方法研究了M a A D H 2 在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明， 乙烯在诱导果实成熟时并没有诱导M a A D H 2 基因的表达量上升，而1 - M C P 在抑制成熟 时，并没有随着内源乙烯被抑制而M a A D H 2 基因的相对表达量下降。 为了研究M a A D H 2 与香蕉果实外源A B A 之间的关系，在正常成熟，A B A 诱导成 熟的条件下，用荧光定量P C R 的方法研究了M a A D H 2 在香蕉果实采后不同成熟阶段的 表达情况。结果表明，A B A 推迟了M a A D H 2 的相对表达量达到最大值的时间。 为了研究香蕉幼苗在逆境胁迫下M a A D H 2 的表达情况，采用R T - P C R 方法研究了 该基因在伤害胁迫、盐胁迫、低温胁迫下的表达情况；采用实时荧光定量P C R 的方法 研究了该基因在干旱胁迫及涝害胁迫下的表达情况。结果表明：伤害胁迫条件下， M 副也H 2 基因在香蕉幼苗叶片中下调表达；盐胁迫条件下，M a A D H 2 基因在香蕉幼苗 叶片中上调表达；在低温胁迫下，M a A D H 2 基因在香蕉幼苗叶片中上调表达；在干旱 胁迫下，轻度干旱诱导了香蕉幼苗根中M a A D H 2 基因的表达，但是随着干旱程度的增 加，M a A D H 2 基因的相对表达量降低；在涝害胁迫下，涝害胁迫诱导了M a A D H 2 在根 中的表达，且在涝害胁迫2 4 小时时，M a A D H 2 的相对表达量达到最大值，而在叶中， M a A D H 2 相对表达量变化很小。我们对正常生长的香蕉幼苗根和涝害胁迫下的香蕉幼 苗根中的M a A D H 2 和M a P D C 活性进行测定发现，在正常生长的香蕉幼苗根中M a P D C 和M a A D H 2 活性维持在很低的水平，而在涝害胁迫下的香蕉幼苗根中，M a A D H 2 和 M a P D C 活性上升，且在2 4 小时达到高峰，然后下降。 根据以上的研究结果，得出了以下结论：我们所克隆的M a A D H 2 基因和香蕉果实 的成熟无关，与香蕉的逆境生理密切相关。 关键词：香蕉( M u s aa c u m i n a t aL A A Ag r o u pC V B r a z i l i a n )M a A D H 2 ；克隆；果实成 熟；胁迫；表达分析 H A b s t r a c t B a n a n ai so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r u i ti nt h ew o r l d ，w h i c hi Sr a n k e da st h ew o r l d S f o u r t hm o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p S o m ea d v e r s i t y , s u c ha sw a t e r l o g g i n ga n dl o wt e m p e r a t u r e a n dS Oo n ，a f f e c tb a n a n as e e d l i n gg r o w t ha n df r u i tp r o d u c t i o nd u r i n gb a n a n ag r o w t ha n d d e v e l o p m e n t B a n a n a f r u i ti sa t y p i c a lc l i m a c t e r i cf r u i t ，w h i c hc o n c e r n sw i t hb a n a n af r u i t q u a l i t ya n ds h e l fl i f e B a n a n as e e d l i n gg r o w t ha n df r u i tr i p e n i n gh a v ead i r e c ti m p a c to nt h e d e v e l o p m e n to f t h eb a n a n ai n d u s t r y A l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，A D H ， E C 1 1 1 1 ) w i d e l yd i s t r i b u t e di nv a r i o u so r g a n sa n dt i s s u e so fp l a n t s A D HW a sf o u n dt op l a y i m p o r t a n tr o l e si np l a n ts t r e s st o l e r a n c e ，g r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，f r u i tr i p e n i n g ，s e n e s c e n c ea n d a r o m a t i cb i o s y n t h e s i s S o ，i n v e s t i g a t i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nA D Ha n db a n a n as e e d l i n g g r o w t ha n df r u i tr i p e n i n gi sa ni m p o r t a n ti s s u e ，w h i c hw i l lo f f e rU Sm o r er e s i s t a n tb a n a n a s e e d l i n g sa n di m p r o v ep o s t - h a r v e s tp r e s e r v a t i o na n dr i p e n i n gt e c h n o l o g y I no r d e rt og a i nab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h em e c h a n i s ma b o u tb a n a n ap o s t h a r v e s t r i p e n i n g ，w ei s o l a t ed i f f e r e n t i a l l yc D N A s a tt h ee a r l y s t a g eo f b a n a n a r i p e n i n gb ys u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n At o t a lo f2 8 9c l o n e si nt h eS S Hl i b r a r ya r es e q u e n c e d B l a s t X s h o w e dt h a ta5 0 0 b pf r a g m e n tw a sv e r ys i m i l a rw i t ho t h e rp l a n t sA D Hg e n e W ed e s i g n e d d e g e n e r a t ep r i m e r st oo b t a i nt w of u l l - l e n g t ho f A D H s n a m e dM a A D H la n dM a A D H 2 T h e f u l ll e n g t ho f M a A D H 2i s11 4 0b pw i t hac o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m e ，e n c o d i n g3 7 9a m i n o a c i d st h a ts h a r e dh i 曲i d e n t i t i e so f9 2 ，9 2 a n d91 w i t ht h a tf r o mA r a b i d o p s i st h a l i a n a , R i c i n u sc o m m u n i s ，O r y z as a t i v ar e s p e c t i v e l y C o n s e r v e dd o m a i na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h i s e D N Ac o n t a i nt w oc o n s e r v e ds i t e s ，A D H _ Ns u p e r f a m i l ya n dN A D B R O s s m a n ns u p e r f a m i l y , w h i c ha r et y p i c a lA D H g e n ed o m a i nm a t c h R e v e r s et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) a n a l y s i ss h o w e dt h a tM a A D H 2w a se x p r e s s e d i nr o o t ，s t e m ，l e a v e ，f l o w e ra n d f i u i t T h ee x p r e s s i o nl e v e lw a sh i g h e ri nr o o t st h a no t h e ro r g a n s T h e r e f o r e ，M a A D H 2m a y p l a ya c e r t a i nr o l ei nd i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s I no r d e rt oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o nb e t w e e nM a A D H 2a n db a n a n ar i p e n i n g ，w em e a s u r e d t h ee t h y l e n ep r o d u c t i o na n da n a l y s e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2a td i f f e r e n ts t a g e s w i t ht h et r e a t m e n to fe t h y l e n ea n d1 - M C P T h er e s u l t ss h o w e dt h a te t h y l e n ei n d u c e dt h e b a n a n af r u i tr i p e n i n gb u td i dn o ti n d u c eM a A D H 2e x p r e s s i o n 1 - M C Pi n h i b i t e db a n a n af r u i t r i p e n i n g H o w e v e r , t h ee x p r e s s i o no f M a A D H 2 d i dn o td e c r e a s ew h e nt h ee n d o g e n o u s e t h y l e n eW a si n h i b i t e d I no r d e rt os t u d yt h er e l a t i o nb e t w e e nM a A D H 2a n de x o g e n o u sA B Ai nb a n a n af r u i t r i p e n i n g ，w ea n a l y s e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2 a td i f f e r e n ts t a g e sw i t ht h et r e a t m e n t I I I o fA B A T h er e s u l t ss h o w e dt h a tA B Ad e l a y e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2t or e a c ha m a x i m u mv a l u e T or e s e a r c ht h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nM a A D H 2a n du n d e r - s t r e s sb a n a n as e e d l i n g s ，W e u s e dR T - P C Rt oa n a l y s et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2i nl e a v e sa ti n j u r ys t r e s s ，s a l ts t r e s s ， l o wt e m p e r a t u r es t r e s s W eu s e dr e a l - t i m eQ P C Rt oa n a l y s et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2 i nl e a v e sa n dr o o t sa td r o u g h ts t r e s sa n dw a t e r l o g g i n gs t r e s s R e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n j u r y s t r e s sn e g a t i v e l yr e g u l a t e dM a A D H 2 e x p r e s s i o n S a l ts t r e s su p r e g u l a t e di t L o wt e m p e r a t u r e i n d u c e di t M i l dd r o u g h ts t r e s si n d u c e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2 ，b u ti ti sd o w nw i t h d r o u g h ti n c r e a s i n g W a t e r l o g g i n gs t r e s si n d u c e d t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f M a A D H 2i nr o o t s ， b u ti tc h a n g e dl i t t l ei nl e a v e s W em e a s u r 圮lM a A D H 2a n dM a P D Ca c t i v i t yi nn o r m a lr o o t s a n d w a t e r l o g g i n gs t r e s sr o o t sa n df o u n dt h a tM a A D H 2 a n dM a P D Ca c t i v i t i e sp e a k e da t2 4 h o u r s ，t h e nd e c l i n e du n d e rw a t e r l o g g i n gs t r e s si nb a n a n ar o o t s A c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s ，t h eM a A D H 2g e n ew a sn o tr e l a t e d t of r u i tr i p e n i n gb u tc l o s e l y r e l a t e dt ov a r i o u so fs t r e s s K e y w o r d s ：M u s aa c u m i n a t aL A A Ag r o u pC V B r a z i l i a n ；M a A D H 2 ；c l o n e ；f r u i t r i p e n i n g ；s t r e s s ；e x p r e s s i o na n a l y s i s I V 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 1 前言11 日U 舌上 1 1 香蕉概述1 1 2 香蕉成熟过程与香蕉品质形成的关系1 1 3 果实成熟的生理学与分子生物学研究概述2 1 3 1 乙烯与果实成熟2 1 3 2 乙烯与香蕉的成熟3 1 3 3A B A 与果实成熟3 1 3 4 果实成熟过程中的基因表达调控4 1 4 乙醇脱氢酶( A D H ) 的研究进展5 1 4 1 植物A D H 概述5 1 4 2A D H 和植物器官发育的关系研究5 1 4 3A D H 和逆境胁迫关系的研究进展7 1 - 5 逆境与香蕉的生长发育8 1 6 研究内容9 1 7 研究目的意义1 0 1 8 技术路线1 0 2 实验材料、试剂及仪器1 0 2 1 实验材料1 0 2 2 实验试剂1 l 2 3 实验仪器1 2 3 材料处理1 3 3 1 香蕉果实的不同处理1 3 3 2 香蕉幼苗不同胁迫的处理1 3 4 方法1 4 4 1 香蕉果实采后乙烯释放量的测定1 4 4 2 香蕉果实采后成熟度的划分1 4 4 3 涝害胁迫下M a A D H 2 和M a P D C 活性的测定1 4 4 4 香蕉不同器官总R N A 提取1 4 4 5 果实采后不同阶段总R N A 提取1 6 4 6c D N A 第一链的合成1 6 4 7M a A D H 2 基因的克隆与生物信息学分析1 6 4 7 1 从香蕉果实c D N A 文库中克隆M a A D H 2 基因5 端1 7 4 7 2M a A D H 2c D N A 全长克隆1 9 4 7 3 生物信息学分析2 0 4 8 半定量R T P C R 2 0 4 8 1c D N A 第一链的合成2 0 4 8 2R T P C R 引物设计2 1 4 8 3P C R 反应2 1 4 9 荧光定量R T P C R 分析M a A D H 2 2 1 4 9 1c D N A 第一链的合成2 1 4 9 2 荧光定量P C R 的引物设计2 1 4 9 3 荧光定量P C R 的反应体系和反应程序2 2 4 9 4 荧光定量P C R 的定量方法2 2 5 结果2 2 5 1M a A D H 2 基因的克隆2 2 5 1 1M a A D H 2 基因5 端的克隆2 2 5 1 2M a A D H 2c D N A 全长克隆2 3 5 2M a A D H 2 基因的序列分析2 3 5 2 1 生物信息学分析2 4 5 2 2 同源性比较2 5 5 2 3 进化树分析2 7 5 3M a A D H 2 基因在香蕉不同器官的差异表达2 8 5 4 乙烯、卜M C P 处理条件下M a A D H 2 基因在香蕉采后不同成熟度的表达量变化2 9 5 5 香蕉采后果实乙烯释放速率的变化规律3 0 5 6A B A 处理，M a A D H 2 基因在香蕉果实采后的表达量变化3 1 5 7 香蕉幼苗在伤害胁迫下，M a A D H 2 基因在香蕉幼苗叶片中的表达特征3 2 5 8 香蕉幼苗在盐胁迫下，M a A D H 2 基因在叶片中的表达特征3 2 5 9 香蕉幼苗在低温胁迫下，M a A D H 2 基因在叶片中的表达特征3 3 5 1 0 香蕉幼苗在干旱胁迫下，M a A D H 2 基因在根中的表达特征3 3 5 1 1 香蕉幼苗在涝害胁迫下，M a A D H 2 基因在根和叶中的表达以及M a A D H 2 和M a P D C 酶活性的变化3 3 5 1 1 I M a A D H 2 基因在涝害胁迫下叶片中的表达变化3 3 5 1 1 2M a - A D H 2 基因在涝害胁迫下香蕉幼苗根中的表达变化3 4 5 1 1 3 涝害胁迫下香蕉幼苗根中M a - A D H 2 和M a - P D C 活性变化3 4 6 讨论3 5 6 1M a A D H 2 基因的克隆与序列分析3 5 6 2M a A D H 2 基因在香蕉采后不同器官的差异表达分析3 5 6 3 乙烯、卜M C P 处理条件下M a A D H 2 基因在香蕉采后不同成熟度差异表达与内源 乙烯释放的关系3 6 6 4A B A 处理条件下M a A D H 2 基因在香蕉采后不同成熟度时的差异表达3 6 6 5M a A D H 2 基因在伤害胁迫，盐胁迫，低温胁迫的香蕉幼苗叶表达3 7 6 6M a A D H 2 基因在干旱胁迫下香蕉幼苗根中的表达3 7 6 7M a A D H 2 基因在涝害胁迫下香蕉幼苗根和叶中的表达3 7 7 结论3 8 参考文献4 0 附录：5 1 致谢5 2 - d L - 。一 1 刖舌 1 1 香蕉概述 香蕉是热带、亚热带发展中国家的最重要作物之一。中国的香蕉产量居世界第四位， 在海南、广东、云南、广西、福建、台湾等地区大面积种植。香蕉及部分大蕉是鲜食水 果中消费量最大的水果，煮食蕉则是产蕉区人民的主要粮食来源。因此发展香蕉生产有 助于解决这些地区普遍存在的粮食短缺及经济落后等问题。出于对香蕉研究的巨大经济 效益和应用前景的考虑，联合国粮农组织( F A o ) 将香蕉列为世界第四大粮食作物，并 设立了香蕉改良计划( B a n a n a I m p r o v e m e n t P r o g r a m ) ，以及国际香蕉改良网络( T h e I n t e m a t i o n a lN e t w o r kf o r t h eI m p r o v e m e n to f B a n a n aa n dP l a n t a i nI N I B A P ) ，并已取得了很 大进展。 香蕉在热带和亚热带地区农业和社会发展中具有重要的作用。从世界范围看，香蕉 贸易是这些地区发展中国家换取外汇的主要方式之一。据统计，2 0 0 1 年世界香蕉出口 值4 2 3 8 亿美元，其中发展中国家从中获取了8 5 5 。香蕉的出口量由1 9 9 7 年的1 5 上 升到2 0 0 1 年的2 0 4 ，并且目前仍在逐年递增，因此发展香蕉生产，增加出口，可以 有助于发展中国家解决贫困问题，促进其经济的发展。就我国的情况来看，相对于其它 地区，热带农业在大宗粮、棉、油作物方面远远不及温带地区。而在热带水果方面却比 其它地区有更大的优势。在我国农业产业结构调整中，热带水果在热带农业中的地位也 将越来越重要。尤其重要的是加入W T O 后，在国际竞争中，热带水果比其它大宗粮食 作物及其产品更具有竞争优势。因此热带水果的发展，可扩大出口或替代进口，可能带 动热带地区大农业的重心逐步向以热带水果为代表的热带作物方向转移。而香蕉作为世 界上产量最大的水果，在其中发挥着龙头作用。大力发展香蕉产业，是我国热带地区农 民脱贫致富的好门路。 1 2 香蕉成熟过程与香蕉品质形成的关系 香蕉果实成熟过程十分复杂，涉及许多复杂生理生化变化，它对香蕉品质形成具有 非常重要的作用。一般对香蕉果实成熟过程可以分采前果实生长发育和采后果实的成 熟。香蕉果实采前的生长发育为单S 型，分为三个时期：I 期，抽蕾后4 周之前为细胞 分裂期；I I 期，抽蕾后4 - - 一1 2 周为细胞膨大期；期，抽蕾后1 2 1 5 周为( 成熟期) 。 香蕉在不同的生长发育期，其果肉的内部发生着复杂的生理生化变化。在P e u m a n s 研究 过程中发现香蕉果实早期发育到成熟阶段蛋白质的含量和种类发生着剧烈的变化，如三 类几丁质酶和几丁质酶相关的蛋白在果实发育的早期阶段含量很高，尤其是三类几丁质 酶占总蛋白的4 0 以上，伴随着果实的成熟三类几丁质酶含量逐渐下降，而成熟相关蛋 白的种类和含量却逐渐增加，如甜蛋白、葡聚糖酶等( P e u m a n se ta 1 2 0 0 2 ) 。除了蛋 白含量和成份变化以外，香蕉果实发育至成熟阶段的其它物质如：果胶、有机酸、芳香 物质和维生素的含量也生相应的变化。另外，果实外观形态的改变也随着果实生长发育 及成熟而改变，如果实颜色，果实硬度，大小。这些物质的改变必定影响到香蕉果实品 质的形成。在商业生产上，一般是在绿熟期采收香蕉。这种香蕉果实从食用品质的角度 讲尚未成熟，需要进行后熟过程才具备最佳的食用品质。香蕉是典型的呼吸跃变型果实， 其采后成熟过程同样涉及许多生理生化变化，包括淀粉转变为糖、结构性碳水化合物的 降解、多酚的降解、乙酸异戊酯的增加和叶绿素的降解，这些变化直接影响香蕉果实的 硬度、涩味、香气、颜色等品质，进而影响到香蕉的商品价值。因此，研究是香蕉果实 成熟过程与香蕉品质形成的关系，将为人工控制香蕉成熟过程及改善香蕉品质方面发挥 着重要作用，也是发展香蕉生产和提高香蕉经济效益的重要保证。 1 3 果实成熟的生理学与分子生物学研究概述 1 3 1 乙烯与果实成熟 乙烯是一种十分重要的植物激素，它调控植物生长和发育的许多方面，如种子萌发、 幼苗生长、开花、果实成熟和器官衰老等。乙烯促进果实成熟的研究，最早始于1 9 2 4 年，D e n n y 观察到乙烯对诱导果实成熟有很高的效率。1 9 3 4 年G a n e 提出乙烯是果实成 熟时的产物，乙烯的存在也许造成了果实相互促进成熟的效应( B i a l ee ta 1 1 9 6 4 ) 。与 此同时，鼬d d 和W e s t ( Z a r e m b i n s k ie ta 1 1 9 9 3 ) 发现采后的苹果放出的二氧化碳量一 度下降至最低，随后又很快上升，最后又下降的现象，他们称之为“跃变”( T h e c l i m a t e r i c ) 。在呼吸跃变同时伴随出现其它与成熟有关的变化，如果实颜色、化学成分、 细胞及组织结构等。同样的现象在包括梨、香蕉、番茄等的许多果实中也有发现。而另 一些果实，如柑桔、草莓、葡萄等在成熟过程中没有明显的呼吸高峰出现。据此B i a l e ( 1 9 6 4 ) 把不同果实分为“跃变型”( C l i m a c t e r i c ) 和“非跃变型”( N o n c l i m a c t e r i c ) 两大 类。跃变型果实在成熟期间出现明显的呼吸高峰，而非跃变型果实则无此高峰。两类果 实的本质区别可归纳为三点：( 1 ) 跃变型果实的呼吸高峰以乙烯为先导，非跃变型果实 则不然；( 2 ) 两类果实对外源乙烯的反应有本质的不同。跃变型果实在外源乙烯的的触 发下，产生内源乙烯的自我催化，即外源乙烯使自然的呼吸峰提早出现。非跃变型果实 的呼吸强度只受外源乙烯的影响，没有内源乙烯的自我催化功能；( 3 ) 跃变型果实在成 熟时发生一系列急速的成分上的变化，并且这种变化与乙烯有关，非跃变型果实的这种 变化与乙烯无关。但是，一个有趣的现象是，虽然非跃变型果实成熟时没有呼吸上升高 峰，但外源乙烯处理能促进呼吸增加，同时也能促进诸如叶绿素破坏，组织软化，多糖 水解等变化( M c G a r v e ye ta 1 1 9 9 5 ；Y a n g 1 9 8 5 ) 。 M c M u r c h i e 等根据两类果实对丙烯( 乙烯类似物，代替乙烯作用) 处理时其乙烯生 成反应不同，提出跃变型果实中乙烯生成有两个调节系统。系统I 负责跃变前果实中低 速率的基础乙烯生成；系统I I 负责跃变时乙烯自我催化而大量形成的乙烯，有些品种 2 短时间内系统形成的乙烯可比系统I 增加几个数量级，非跃变型果实乙烯生成速率相 对较低，变化平稳，整个成熟过程中只有系统I 活动，缺乏系统。 在果实的组织中存在乙烯的受体尚缺乏直接的证据。推测，果实中同样存在与营养 体中相似的乙烯受体，它可能是一种含Z n 2 + 或C u + 的金属蛋白。由于乙烯的作用依赖于 氧，推测这种金属蛋白受体只有被一种氧化酶氧化成氧化态后才能被乙烯激活，进而引 起有关基因的活化和一系列代谢上的变化。A g + 与Z n 2 + 和C u + 的结构相似，可取代Z n 2 + 或C u + 与金属蛋白结合，使乙烯一受体复合物失活，从而抑制乙烯原初反应的发生，这 可能是A g + 具有拮抗乙烯的作用、被广泛用于花卉保鲜的原因。概括地说，乙烯在果实 成熟过程中有双重的作用：其一是它激活一些基因，这些基因的产物是果实成熟所必须 的。乙烯的这种作用具有发育的阶段性和组织上的特异性。其二是它调节由发育信号所 调节m R N A s ( 如聚半乳糖醛酸酶) 的翻译。此外，乙烯还可以通过调节转录后的某些过 程( 如m R N A 在细胞质内的运输) 来调节与果实成熟有关的基因的表达。 1 3 2 乙烯与香蕉的成熟 香蕉属于典型的跃变型果实( 曾骧1 9 9 2 ) 。许多实验都证明香蕉的成熟过程是由 乙烯所诱导，并产生呼吸高峰( A b e l e s 1 9 7 3 ；B u r ge ta 1 1 9 6 2 ) 。D o m i n g u e z 和V e n d r e l l 对香蕉果实采后的乙烯释放速率，乙烯形成酶( e t h y l e n ef o r m i n ge n z y m e ，E F E ) 活性， 呼吸强度，果皮和果肉的A C C 含量进行了较为系统的研究。研究结果表明：在香蕉成 熟过程中，乙烯生成量的提高稍早于呼吸跃变和其它生理过程，如淀粉水解，叶绿素的 降解。A C O 活性的增加先于其它明显的生理变化之前，说明内源乙烯浓度提高到一定 水平后，就可以诱导跃变。果皮和果肉在成熟过程中的作用是不同的。果皮几乎不产生 乙烯，果肉乙烯生成量较大，而且果皮所发生的变化是由果肉诱导的。在香蕉后熟过程 中，A C O 活性的增加发生在乙烯生成量增加之前，A C O 活性的增加导致乙烯峰出现， 其活性随后降低，这可能是通过调节该酶的辅因子，如维生素C 、一些离子等的浓度来 实现的( L i ue ta 1 1 9 9 9 ) 。在跃变期前香蕉中A C C 含量低，表明A C C 限制着香蕉乙烯自 我合成过程的启动。A C O 增加与乙烯生成同步，但当A C C 含量达到最大值时，乙烯产 量开始下降( D o m i n g u ee ta 1 1 9 9 3 ) 。已有的研究结果表明，A C O 的活性是启动乙烯自 我催化合成的关键因子，当乙烯合成开始增加时，则诱导A C S 活性增加，A C C 含量提 高，A C C 氧化酶活性同时进一步提高，乙烯自我催化作用开始进行( L i ue ta 1 1 9 8 5 ) 。 1 3 3A B A 与果实成熟 脱落酸( A B A ) 也是植物体内一种重要的内源激素，具有促进种子休眠、气孔关闭 和器官脱落等生理功能，但有关A B A 对果实成熟的生理作用的报道却并不多。A B A 作 为一种内源激素在发挥其生理功能前必须与其受体蛋白( 或称结合蛋白) 结合。现已证 明A B A 结合蛋白广泛存在于气孔保卫细胞膜上，根尖与叶肉细胞内也存在A B A 结合 蛋白。但直到近几年才发现果肉细胞中也存在符合受体结构特性的A B A 特异结合蛋白， 同A B A 浓度在果实发育成熟过程中有规律性变化一样，A B A 结合蛋白与A B A 的亲和 力和最大容量在果实发育成熟的不同阶段也有相似的规律性变化。在果实始熟时结合蛋 白对A B A 的亲和力显著提高，这可能是A B A 启动果实成熟的前提。利用A B A 处理果 实，可以诱导果实的成熟，对跃变型果实可以使乙烯呼吸高峰提前。目前对果实成熟有 效生理调控的化学药剂还很少，并且对其调控机理的研究更少，而且大多都集中在跃变 型果实研究。对于非跃变型果实，其成熟与外源激素的相关性及机调控机理，及是否能 启动此类果实的成熟，这些问题长期以来一直成为植物生理学家和园艺学家关注的热点 之一。 1 3 4 果实成熟过程中的基因表达调控 果实生长发育中基因的表达调控对果实的成熟具有非常重要的作用。果实成熟的关 键酶A C C 氧化酶( A C O ) 和A C C 合成酶( A C S ) 基因均已被克隆，通过对克隆到的 基因A C O 和A C S 研究发现，其在乙烯生物合成及信号转导过程中起非常重要的作用。 成熟发生时，体内A C O 的活性快速升高，然后急剧下降。在跃变前可以检测到A C O 基因( M A A C 0 1 ) 的表达，随着跃变的发生表达量也升高，并在随后的成熟过程中依 然维持一个相对高的表达量。A r g u e s o 等指出A C S 是乙烯生物合成关键酶，而在像果实 成熟这样的高浓度乙烯的条件下，A C O 才往往是乙烯生物合成的限速步骤。因此可以 推测果实采后成熟过程中诱导成熟的乙烯生物合成是受乙烯生物合成关键酶基因在转 录水平上调控的，而且在乙烯生物合成的不同阶段是受基因家族不同成员的调控，其中 M a A C S l 是在跃变发生时起调控作用，M a A C 0 1 是在跃变前起调控作用，并于跃变时 表达量也迅速提高。成熟果实中乙烯的生物合成是以反馈方式进行自我调控，在果肉中 是负反馈的，在果皮中是正反馈的( A r g u e s oe ta 1 2 0 0 7 ) 。与