拮抗酵母对柑橘采后病害的防治效果及其作用机理初探

西藏拮抗酵母对柑橘采后病害的防治效果及其作用机理初探Evaluation of Antagonistic Yeast from Tibet against Postharvest Decay of Citrus and its Mechanism摘要从西藏地区分离和筛选对柑橘主要采后病害绿霉病和青霉病具有良好生防治果的耐低温拮抗酵母。其中一株效果显著，经鉴定为罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）。当该酵母细胞悬浮液浓度为108 个/mL时，在4下分别能抑制柑橘绿霉病和青霉病发病率至30%和20%，而相同条件下对照的发病率为100%。该酵母不同处理液的体内试验和体外孢子萌发试验结果表明其主要作用机理仍为与病原菌的营养和空间的竞争作用。而其分泌的生防相关酶活性较高，是其低温生防效果良好的另一主要原因。该酵母胞内高含量的海藻糖和脯氨酸使其对低温的耐受性增强，从而在低温条件下能够更好地抑制水果病原菌的生长，达到防腐保鲜效果。同时本论文也证明了从高寒地区获得耐低温拮抗酵母的可能性。关键词:生物防治、采后、罗伦隐球酵母、西藏、柑橘AbstractCold-adapted yeasts were isolated from Tibet and evaluated as a potential biocontrol agents against green mold(Penicillium digitatum )and blue mold (Penicillium italicum) of citrus fruit in cold storage. One strain of the yeasts, an isolate identified as Cryptococcus laurentii, was found to exhibit the greatest biocontrol activity among the different isolates that were screened. A concentration of 108 cells/mL of the strain reduced the incidence of decay of green mold and blue mold to 30% and 20% in cold storage, respectively, compared to the control where decay incidence was 100%. In vivo and in vitro experiments of the yeast indicated that its major mechanism is to compete for nutrients and space with pathogens. Higher enzyme activity also allowed the strain of yeast to perform better biocontrol activity in cold storage. Besides, higher intracellular level of trehalose and proline provided in the strain of yeast increased the tolerance of this strain to low temperatures and effectively protect citrus from pathogens in cold storage, relative to the other strains that were evaluated. Apparently the present study demonstrated the ability to select cold-adapted yeasts from cold climates and use them as biocontrol agents of postharvest diseases of fruit placed in cold storage. Key words: Biocontrol, Postharvest, Cryptococcus laurentii, Tibet, Citrus目 录摘要1Abstract12 实验材料与方法62.1 主要仪器62.2 试剂62.3 受试果实72.4 病原菌72.5 拮抗酵母82.6 西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验82.7 菌种鉴定92.8 西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果92.9 西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果102.10 西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果112.11 拮抗酵母生防相关酶活测定112.11.1 酶的提取112.11.2 几丁质酶活性的测定112.11.3 b-1,3-葡聚糖酶活性的测定122.12 拮抗酵母耐低温物质含量测定122.12.1 样品制备122.12.2 海藻糖含量的测定122.12.3 脯氨酸含量的测定122.13 数据处理与分析133 结果与分析133.1西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验133.2 菌种鉴定143.3西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果143.4西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果183.5西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果223.6拮抗酵母生防相关酶活测定243.7拮抗酵母耐低温物质含量测定254 讨 论26参考文献27致 谢301 前言我国是世界水果生产的第一大国，其中营养丰富、味道甜美的柑橘产量也位居世界首位。但每年因侵染性病害造成柑橘采后腐烂严重，经济损失巨大。柑橘贮运过程中，引起柑橘腐烂的常见侵染性病害主要有指状青霉(Penicillium digitatum Sacc)引起的绿霉病和意大利青霉(Penicillium italicum Wehmer)引起的青霉病1-7。为了延长货架期，通常将柑橘储置于低温储藏（0-5），但仍发生大量青霉病和绿霉病病害。长期以来，高效、经济的化学杀菌剂是柑橘采后病害防治的主要方法，如抑霉唑、特克多、邻苯酚钠、仲丁胺以及苯并咪唑类（如多菌灵、托布津）杀菌剂等2, 4-7。但是，长期使用同一种杀菌剂会出现病原菌的抗药性问题从而使杀菌剂的防治效果大大降低，同时抗药性菌株对甲基托布津、苯来特、涕必灵等三种苯并咪唑类杀菌剂具有交叉抗性8，另外农药残留、危害人类健康和环境污染等一系列问题也越来越得到消费者的重视9。因此开发新型绿色环保的生物防腐保鲜剂成为当今水果采后保鲜的研究热点，其中具有拮抗作用的酵母菌作为生物防治剂，由于其具有拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点成为近20年来研究的主要对象，研究工作主要集中在筛选和应用能够抵抗由水果病原真菌引起的果实采后病害4, 10-12。然而，拮抗酵母所存在的缺点也限制了它的推广和应用，尤其是酵母菌在环境中的不稳定性和较短的货架期这两个问题最为突出13。而引起这些问题的主要原因是由于酵母菌株在施用过程中会受到不同环境条件的影响，包括氧化胁迫、渗透胁迫、高温胁迫和低温胁迫等。而解决低温胁迫问题的方法之一便是筛选获得具有耐低温适应性的拮抗酵母，特别是从一些具有极端条件的地区获得，如南极洲、极地的水中，海洋和其他寒冷地区14, 15。青藏高原，被誉为“世界第三极”，远离海洋，低纬度，高海拔，疆域辽阔，地形复杂、高差变化极为悬殊，植被类型多样，区系成分复杂，其独特的地理环境、高原气候造就了极富特色的自然资源，包括微生物资源。但是目前，国内对于利用西藏菌种资源进行生物防治研究的报道还不多，所研究的菌种基本都属于细菌和放线菌。Zhao, J.等16研究了来自西藏的一株链霉菌对香瓜的生物防治作用。本论文旨在现有的生物防治研究的基础上，以西藏微生物资源开发利用和柑橘生物防腐保鲜剂的开发为目的，系统研究从西藏地区分离在低温条件下对柑橘采后病害具有良好防治效果的拮抗酵母，探讨其在低温条件下对柑橘采后病害的生物防治效果及其作用机理，优化其生物防治的条件，建立以西藏拮抗酵母为生防菌的柑橘生物防腐保鲜方法以期替代化学方法来减少柑橘果实采后的经济损失，具有非常重要的意义和研究价值。2 实验材料与方法2.1 主要仪器XLS-3750立式圆形压力蒸汽灭菌锅：日本三洋公司。 SW-CJ-1F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司SIGMA 3K-15离心机：德国希格玛（SIGMA）公司冷冻离心机（SAGMA3K15）：美国sigma公司QYC-211全温空气摇床：上海福玛实验设备有限公司Sartrious电子天平：北京赛多利斯天平有限公司20 ml、200 ml、1000 ml EX系列移液器：日本立洋（NICHIPET）公司 血球计数板（2516）：上海医用光学仪器厂光学显微镜：日本奥林巴斯有限公司LRH-250生化培养箱：上海一恒科技有限公司VITEK-32全自动微生物鉴定：法国生物梅里埃（biosMerieumx）公司酶标仪（SPECTRAmax Plus348）：美国分子仪器公司（MDA）自动样品研磨机：上海净信科技公司超低温冰箱：日本Panasonic公司旋涡振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司氨基酸分析仪L8900：日本日立公司2.2 试剂NYDB培养基： 营养肉汤, 8 g/l; 酵母粉, 5 g/l; 葡萄糖, 10 g/l; 121 灭菌20 min，待用；NYDA培养基：营养肉汤, 8 g/l; 酵母粉, 5 g/l; 葡萄糖, 10 g/l; 琼脂 20 g/l；121灭菌20 min，待用；PDB培养基（马铃薯葡萄糖培养基）：200 g去皮马铃薯加水煮 30 min 后过滤，滤液中加入 20g葡萄糖，用蒸馏水定容，至1000 mL，121灭菌20 min，待用。PDA培养基（马铃薯葡萄糖培养基）：200 g去皮马铃薯加水煮 30 min 后过滤，滤液中加入 20g葡萄糖，20g琼脂，用蒸馏水定容，至1000 mL，121灭菌20 min，待用。2.3 受试果实选取正常商业成熟度的果实，要求饱满圆润、外观整齐、无干枯、无机械损伤、无病害。受试柑橘品种为椪柑（Citrus poonensis），果实采摘于商业成熟期，采摘后立即运往实验室进行处理，或是贮藏在室温（2025）, 相对湿度92-94%的环境中，48 h内使用。17果实预处理步骤为：用0.1%次氯酸钠(NaOCl)溶液浸泡消毒1分钟左右后，用自来水反复冲洗，最后在室温下晾干，待用。2.4 病原菌试验用病原菌为指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum），从当地腐烂的果实上分离。菌种均用PDA斜面培养基28培养7-14 d后于4保存待用。从病原菌保存斜面中挑取适量的霉菌孢子，在PDA斜面上划线，置于培养箱中，在28培养7天后，用接种环在培养好的霉菌试管斜面上刮取适量孢子，转移到适量无菌水溶液中，用血球计数板计数，并用无菌水调整至5104个/mL，待用。182.5 拮抗酵母试验用拮抗酵母为本实验室从西藏拉萨地区、那曲县、尼木县和日喀则地区(9111 E, 2997 N，海拔 3500 m)的121份土样中分离得到。土样是在室温为0至10的环境条件下收集后在4下保存待用。1g土样加入100mL无菌水并稀释制成10-2、10-3 和10-4 g/mL浓度梯度，各取100L涂布于虎红培养基。在28条件下培养3至5天，可根据酵母的形态学特征进行分离和纯化。每个处理3个平行，试验重复2次。分离纯化后的46株菌种均用NYDA斜面培养基28培养3-5d后于4保存待用。这46株西藏酵母通过在柑橘上生防效果试验进行初步筛选。将酵母菌株活化后接入含有50 mLNYDB的三角瓶中， 28下，200 r/min培养24 h。得到的发酵液在3000 r/min下离心10min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为1108 个/mL，待用。用无菌的打孔器在每个果实的赤道部位制造伤口（5 mm3 mm），接种50 L酵母细胞悬浮液，3 h后，再接种30 L 浓度为1104个/mL扩展青霉孢子悬浮液，晾干。将果实放置于塑料筐中，外套塑料保鲜膜以保持湿度（95左右）。处理果实分别贮于室温（2025）和低温（0-4）的环境条件下，并于7天和30 d后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有5个果实，3个平行，试验重复2次。本论文采用的西藏酵母是对柑橘青霉病的抑制率大于40的酵母菌株共5株，分别记作西藏酵母菌株尼木号、胶红1、胶红2、萝卜2号和红叶小召。另外还有一株实验室保藏菌种罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner），该酵母已被证明是一种较好的生防保鲜制剂18，本论文以其作为阳性对照。这6株酵母均用NYDA斜面培养基28培养3-5d后于4保存待用。2.6 西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验将上述5株西藏酵母和实验室罗伦隐球酵母活化后接入含有50 mL NYDB的三角瓶中，28下，200 r/min培养24 h。得到的发酵液在3000 r/min下离心10min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体2次，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为1108 个/mL，待用。用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm），分别接种30 L上述6种酵母细胞悬浮液，3 h后，再接种20 L 浓度为5104 个/m指状青霉的孢子悬浮液，晾干。将果实放置于塑料筐中，外套塑料保鲜膜以保持湿度（95左右）。处理果实分别贮于室温（2025）和低温（0-4）下，并于4天和18天后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有12个果实，3个平行，试验重复2次。2.7 菌种鉴定利用26S D1/D2区间序列测定上述在柑橘果实体内复筛试验得到的一株效果最好的西藏拮抗酵母。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）抽提酵母DNA。利用Kurtzman和Robnett19描述的引物NL1 5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3和NL4 5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3进行聚合酶链式反应（PCR）。萃取得到的PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测得的序列在NCBI数据库中进行Blast，进行菌株鉴定(http:/blas- /Blast.cgi)。对所得的基因序列用MEGA v.5.0软件包采用邻接法进行系统进化分析20。参考序列从基因文库中获得。2.8 西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果将酵母菌株C. laurentii活化后接入含有50 mL NYDB的三角瓶中， 28，200 rpm条件下培养24 h。发酵液在3000 rpm下离心10 min，弃上清液，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母细胞悬浮液，血球计数板计数，用无菌水调整至所需浓度，待用。21选取柑橘果实洗净后置于塑料筐内，用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm）。4个处理分别为：（A）1106 个/mL C. laurentii；（B）1107个/mL C. laurentii；（C）1108 个/mL C. laurentii；（D）1109 个/mL C. laurentii；对照为无菌水。在每个果实伤口接种30L C. laurentii细胞悬浮液处理液，3h后，分别接入浓度为 5104 个/mL扩展青霉或意大利青霉病原菌孢子悬浮液。果实晾干后，用保鲜膜封口以保持湿度（95左右），处理果实贮于室温（2025）和低温（0-4）下，并于4天和18天后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有12个果实，3个平行，试验重复2次。2.9 西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果将酵母菌株C. laurentii活化后接入含有50 mL NYDB的三角瓶中，28，200 r/min条件下培养24 h。发酵液在3000 r/min下离心10 min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，再用无菌水制备成以下处理液：（1）酵母培养原液：用血球计数板计数，并用滤液调整至浓度为1108cells/m1；（2）酵母细胞悬浮液，培养液在3000 r/min下离心10 min后，除去上清液，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为1108 个/mL；（3）酵母滤液：培养液在3000 r/min下离心10 min后，取上清液，用无菌滤纸（滤膜0.45 ）过滤即得；（4）酵母热杀死液：将培养原液在121下高压灭菌20 min。参照zhang等（2007）方法22, 23研究C.laurentii不同处理液对柑橘采后指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的抑制效果。选取柑橘果实洗净后置于塑料筐内，用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm）。以无菌水为对照，依次将上述酵母处理液加入果实伤口，各30 L，3 h后，分别接入浓度为 5104 个/mL扩展青霉或意大利青霉病原菌孢子悬浮液。果实晾干后，用保鲜膜封口以保持湿度（95左右），处理果实贮于室温（2025）和低温（0-4）下，并于4天和18天后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有12个果实，3个平行，试验重复2次。2.10 西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果采用PDB试验研究C. laurentii对病原菌孢子萌发的抑制作用。在无菌的含有5 mL PDB 的玻璃试管中接种100L 1107 个/mL指状青霉（Penicillium digitatum）或意大利青霉（Penicillium italicum）孢子悬浮液和100L 1108 个/mL C. laurentii或无菌水，4 ，200 rpm下培养3天。然后在40倍显微镜下镜检200个孢子，观察出芽率。24每个处理3个平行，试验重复2次。2.11 拮抗酵母生防相关酶活测定2.11.1 酶的提取将实验室罗伦隐球酵母菌株和西藏酵母菌株C. laurentii活化后分别接入含有50 mL NYDB的三角瓶中，4，200 r/min条件下培养10天。培养液在3000 r/min下离心10 min后，取上清液，用无菌滤纸（滤膜0.45 ）过滤，取滤液进行酶活测定。2.11.2 几丁质酶活性的测定几丁质酶活性的测定参照Baty等25的方法，略有改动。将500ug/mL N-乙酰葡萄糖胺（NAG）稀释成100g/mL，用此溶液稀释成不同浓度梯度，然后取几支干净的试管分别装入不同浓度的N-乙酰葡萄糖胺溶液1.5mL，加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，在沸水浴中保温10min，取出试管后在OD530nm处比色，记录OD值，绘制标准曲线。取酶液1mL加入0.1mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液（含1%胶体几丁质）1mL，在37保温1h，加DNS试剂2mL，在沸水浴中保温10min，冷却至室温后在1500g离心8min，在OD530处比色，计算NAG的量。每个处理3个平行，试验重复2次。酶活力定义：上述条件下，每小时释放100g的酶量为一个酶活力单位。3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂的制备：酒石酸钾钠18.2g，溶于50mL蒸馏水中，45水浴加热，依次加入3,5-二硝基水杨酸（DNS）0.63g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，亚硫酸钠0.5g，搅拌至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中。2.11.3 b-1,3-葡聚糖酶活性的测定b-1,3-葡聚糖酶活性的测定参照Ippolito等26的方法。0.25mL 50mmol l1醋酸缓冲液（pH 5.0）配制的浓度为0.2%（w/v）昆布多糖（Sigma）溶液，0.25mL酶提取液50mmol/L醋酸缓冲液。在37水浴保温1h后，加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，在沸水浴加热5min，取出试管，冷却后在500nm处测定吸光度值。并以反应0h样品同时作为空白。以每小时酶提取液分解产生1mg葡萄糖作为一个酶活力单位（U），酶活性以U mL1表示。每个处理3个平行，试验重复2次。2.12 拮抗酵母耐低温物质含量测定2.12.1 样品制备将实验室罗伦隐球酵母菌株和西藏酵母菌株C. laurentii活化后分别接入含有50 mL NYDB的三角瓶中，4，200 r/min条件下培养10天。培养液在3000 r/min下离心10 min后，用无菌蒸馏水洗涤2次，洗净后的酵母细胞作为海藻糖和脯氨酸含量测定的样品。2.12.2 海藻糖含量的测定采用蒽酮比色法27测定酵母细胞内海藻糖的含量。往酵母样品中加入1mL 0.5mol/L三氯乙酸冰浴60分钟，同时每15分钟振荡一次。离心后取上清液，并用无菌蒸馏水稀释2倍。每毫升样品加入1mL0.2%的蒽酮溶液，震荡摇匀后在沸水浴中反应5 min，取出立即在冰浴中冷却至室温，摇匀，于590 nm处测定吸光度。每个处理3个平行，试验重复2次。2.12.3 脯氨酸含量的测定 脯氨酸含量的测定参照Morita等28的方法。酵母样品煮沸10分钟后，12000 r/min下离心10 min，取上清液用氨基酸分析仪进行定量。脯氨酸含量用酵母干重的百分比表示。每个处理3个平行，试验重复2次。2.13 数据处理与分析采用SPSS（Version20.0）统计软件进行数据统计，数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法分析（取p0.05）。3 结果与分析3.1西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验对已经初筛得到的5株西藏酵母在常温和低温条件下，以无菌水作为阴性对照，以罗伦隐球酵母作为阳性对照，探究其对柑橘绿霉病的抑制效果，结果如下表3-1所示。结果显示，西藏拮抗酵母萝卜2号在低温条件下对柑橘绿霉病的抑制效果最佳，发病率降到22.22%，与无菌水和罗伦隐球酵母相比具有显著性差异。其余几株西藏酵母与阴性对照无菌水相比，发病率和病斑直径均有下降且具有显著性差异，但是与阳性对照罗伦隐球酵母相比，并无显著性差异。因此，选择西藏酵母萝卜2号进行进一步试验探究。表3-1 西藏拮抗酵母在常温和低温条件下对柑橘绿霉病的生防效果酵母菌株20 (4天)4 (18天)发病率 (%)病斑直径(mm)发病率 (%)病斑直径 (mm)无菌水72.222.78a3.580.58a1000.00a2.240.13aC. laurentii25.009.62b0.820.35b41.670.0.b0.460.01b尼木号10.255.12b0.190.10b33.338.33bc0.480.13b胶红120.207.07b0.560.32b30.552.78bc0.330.05b胶红220.205.97b0.850.15b47.2210.01b0.560.11b萝卜2号25.008.33b0.640.20b22.229.62c0.310.08b红叶小召27.785.55b0.670.07b30.552.78bc0.440.06b3.2 菌种鉴定根据前期试验结果，利用26S D1/D2区间序列测定对效果最好的一株西藏酵母萝卜2号进行菌种鉴定。确定其菌种为Cryptococcus laurentii（罗伦隐球酵母），并构建了进化树（见图3-1）。图3-1 西藏酵母萝卜2号进化树3.3西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果用不同浓度的西藏罗伦隐球酵母对柑橘进行处理，观察其在常温和低温条件下对采后病原菌指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的抑制效果，结果（见图3-2、3-3、3-4、3-5）显示，西藏罗伦隐球酵母在常温和低温条件下都对柑橘采后指状青霉引起的绿霉病和意大利青霉引起的青霉病具有明显的抑制效果，经西藏罗伦隐球酵母处理的柑橘，其发病率和病斑直径都明显低于对照。西藏罗伦隐球酵母细胞悬浮液浓度对抑制效果有显著的影响，浓度越高，柑橘采后绿霉病和青霉病的发病率越低。当酵母菌悬浮液达到1109 个/mL时，常温下绿霉病和青霉病的发病率分别为16.67%和8.33%，低温下绿霉病和青霉的发病率分别为11.11%和6.55%，显著低于对照，其病斑直径也低于其他处理。图3-2西藏罗伦隐球酵母在常温下不同浓度细胞悬浮液对柑橘绿霉病的抑制效果：（A）1106 个/mL；（B）1107 个/mL；（C）1108 个/mL；（D）1109 个/mL；对照为无菌水图3-3西藏罗伦隐球酵母在低温下不同浓度细胞悬浮液对柑橘绿霉病的抑制效果：（A）1106 个/mL；（B）1107 个/mL；（C）1108 个/mL；（D）1109 个/mL；对照为无菌水图3-4西藏罗伦隐球酵母在常温下不同浓度细胞悬浮液对柑橘青霉病的抑制效果：（A）1106 个/mL；（B）1107 个/mL；（C）1108 个/mL；（D）1109 个/mL；对照为无菌水图3-5西藏罗伦隐球酵母在低温下不同浓度细胞悬浮液对柑橘青霉病的抑制效果：（A）1106 个/mL；（B）1107 个/mL；（C）1108 个/mL；（D）1109 个/mL；对照为无菌水3.4西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果 通过体内（in vivo）试验研究西藏罗伦隐球酵母在常温和低温条件下不同处理液对柑橘采后病原菌指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的抑制效果，结果（见图3-6、3-7、3-8、3-9）显示，西藏罗伦隐球酵母的不同处理液（培养液滤液、热杀死液、1108 个/mL培养原液、1108 个/mL细胞悬浮液）作用于柑橘，在常温和低温条件下都是浓度为1108 个/mL的西藏罗伦隐球酵母细胞悬浮液对两种病原菌的抑制效果最好，在常温下绿霉病和青霉病的发病率分别为22.22%和16.67%，在低温下绿霉病和青霉病的发病率分别为22.22%和24.97%，和对照相比均有显著性生防效果。培养原液和滤液对这两种病原菌也有一定的抑制作用，但其抑菌效果比酵母细胞悬浮液要差，且培养原液和对照相比具有显著性差异，而滤液虽对发病率和病斑直径有所降低，但和对照相比没有显著性差异。西藏罗伦隐球酵母在常温和低温条件下热杀死液均对柑橘采后绿霉病和青霉病没有抑制效果。图3-6西藏罗伦隐球酵母在常温下不同处理液对柑橘绿霉病的抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水 图3-7西藏罗伦隐球酵母在低温下不同处理液对柑橘绿霉病的抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水图3-8西藏罗伦隐球酵母在常温下不同处理液对柑橘青霉病的抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水图3-9西藏罗伦隐球酵母在低温下不同处理液对柑橘青霉病的抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水3.5西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果通过PDB孢子萌发试验，研究西藏罗伦隐球酵母在低温条件下（4）不同处理液对指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的孢子萌发抑制效果。试验结果（见图3-10、3-11）显示，在3天潜伏期后，3种西藏罗伦隐球酵母处理液能够显著降低指状青霉和意大利青霉的孢子萌发率，其中以1108 个/mL细胞悬浮液抑制效果最好，对指状青霉和意大利青霉的孢子萌发抑制率分别达到20.88%和17.23%，相比与对照分别降低了72%和73%，1108 个/mL培养原液抑制效果其次，滤液抑制效果最次。而热杀死液对指状青霉和意大利青霉的孢子萌发没有抑制效果。图3-10 西藏罗伦隐球酵母在低温条件下不同处理液对指状青霉（Penicillium digitatum）的孢子萌发抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水图3-11 西藏罗伦隐球酵母在低温条件下不同处理液对意大利青霉（Penicillium italicum）的孢子萌发抑制效果：（A）滤液；（B）热杀死液；（C）1108 个/mL培养原液；（D）1108 个/mL细胞悬浮液；对照为无菌水3.6拮抗酵母生防相关酶活测定 实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母在低温条件下（4）于NYDB培养基中培养10天后获得的滤液测用来定几丁质酶和 1, 3-葡聚糖酶的活性。结果（见图3-12，3-13）显示，西藏罗伦隐球酵母的几丁质酶和 1, 3-葡聚糖酶的活性都比实验室罗伦隐球酵母高，分别是实验室罗伦隐球酵母的30.82倍和1.06倍。图3-12 在低温条件下（4）培养10天后实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母的几丁质酶活性图3-13 在低温条件下（4）培养10天后实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母的 1, 3-葡聚糖酶的活性3.7拮抗酵母耐低温物质含量测定实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母在低温条件下（4）于NYDB培养基中培养10天后测定海藻糖和脯氨酸的含量。结果（见图3-14,3-15）显示西藏罗伦隐球酵母的海藻糖和脯氨酸的含量都比实验室罗伦隐球酵母高，分别是实验室罗伦隐球酵母的1.41倍和1.10倍。图3-14 在低温条件下（4）培养10天后实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母的海藻糖的含量图3-15 在低温条件下（4）培养10天后实验室罗伦隐球酵母和西藏罗伦隐球酵母的脯氨酸的含量4 讨 论生防试剂在施用过程中受到多种环境条件的影响29，为延长保质期，多数水果被储存在0至5的低温环境中，所以低温胁迫是拮抗酵母最常见的逆境。因此，开发在低温环境下具有良好生防效果的生防制剂具有重要意义。目前，已经有一些研究报道从南极地区、海洋和其他寒冷地区获得了具有耐低温的酵母，并测定其生防效果30, 31。本论文采用相似的方法从西藏地区获得具有低温耐受能力的采后拮抗酵母。在前期筛选试验中，实验室已经获得了5株生防效果较好的西藏拮抗酵母，这5株酵母便作为本论文在柑橘水果上试验的对象，而实验室保藏的已证明具有较好生防效果的罗伦隐球酵母（C. laurentii）菌株22作为本论文的阳性对照。筛选结果表明（表3-1），西藏拮抗酵母萝卜2号在低温条件下（4）对柑橘绿霉病的抑制效果最佳，发病率降到22.22%，与无菌水和阳性对照实验室罗伦隐球酵母相比具有显著性差异。利用26S D1/D2区间序列测定对萝卜2号进行菌种鉴定，结果如图3-1显示其菌种为Cryptococcus laurentii（罗伦隐球酵母）。该酵母进一步生防效果试验表明，如图3-2、3-3、3-4、3-5所示，随着细胞悬浮液浓度增高，在常温和低温条件下柑橘采后绿霉病和青霉病的发病率都逐渐降低，确定最佳浓度为1108 个/mL。通过体内和体外酵母不同处理液的生防效果试验，结果如图3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11所示，在低温条件下，酵母的细胞悬浮液具有最好的生防效果。这个结果说明，在低温条件下，萝卜2号的生防机理主要是通过与病原菌在空间和营养上的竞争作用。这个结论与Sharma等的理论一致32。此外，萝卜2号的细胞滤液也能够在一定程度上降低柑橘青霉病和绿霉病的发病率和减小病斑直径，说明萝卜2号也可能分泌一些对病原菌具有抑制效果的代谢产物。通过与阳性对照比较，该酵母的低温生防作用机理得到进一步阐述，结果如图3-12，3-13所示，酵母在低温条件下培养10天后，萝卜2号的几丁质酶和 1, 3-葡聚糖酶的活性都比实验室罗伦隐球酵母高，且具有显著性差异，分别是实验室罗伦隐球酵母的30.82倍和1.06倍，而这两种酶活的差异性对这两株酵母生防效果的不同发挥了重要作用，正如Bar-Shimon等报道一致33-35。此外，海藻糖和脯氨酸对保护微生物或植物细胞免受低温胁迫和渗透胁迫具有重要的作用36-39。而图3-14和3-15结果显示萝卜2号的海藻糖和脯氨酸的含量都比实验室罗伦隐球酵母高，且具有显著性差异，分别是实验室罗伦隐球酵母的1.41倍和1.10倍。综述所述，本论文研究结果表明从西藏分离筛选得到的罗伦隐球酵母（萝卜2号）在低温条件下对柑橘采后的绿霉病和青霉病具有较好的生防效果，并且证明其作用机理主要是与病原菌进行营养与空间竞争，而相比与实验室罗伦隐球酵母，西藏罗伦隐球酵母在低温条件下具有更好的生防效果的原因可能与其细胞活性有关。胞内更高含量的耐低温物质（海藻糖和脯氨酸），使该酵母具有更好的低温耐受能力，从而保证其在低温条件下产生生防相关酶活性更高，进而具有更好的生防效果。参考文献1 刘霞. 柑橘果实采后酸腐病侵染规律及防治技术的研究 博士: 浙江大学; 2009.2 刘霞, 刘莉, 王鹏, 郑晓冬. 罗伦隐球酵母对柑橘采后酸腐病的抑制效果J. 浙江师范大学学报(自然科学版). 2010(01):13-7.3 王一非. 海洋拮抗酵母Rhodosporidium paludigenum对果实采后病害生物防治的研究 博士: 浙江大学; 2008.4 邓雨艳, 曾凯芳. 柑橘果实采后侵染性病害防治技术研究进展J. 食品科技. 2008(04):211-4.5 郭娟华, 涂起红, 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