课件：骨髓检查组化免疫分型遗传学.ppt

骨髓细胞学检查,湘潭市中心医院检验科 曾国强,二、骨髓细胞学检查的内容、方法和临床意义,p293,骨髓标本采集要求 标本采集的注意事项： 形态检查抽吸量不超过0.2ml； 同时进行多项检查应优先抽吸形态检查标本； 涂片厚薄适宜，不少于4张，并同时制作配套的血片； 作好标记； 如干抽，此时应考虑作骨髓活检； 多部位或对有压痛点或根据X线检查提示进行穿刺，以提高阳性率 。,判断骨髓取材成功的标准,抽吸骨髓液时，病人有特殊酸痛感； 有骨髓小粒和脂肪滴； 显微镜下可见到骨髓特有细胞，如巨核细胞、成骨细胞、破骨细胞、浆细胞、组织嗜碱细胞、纤维细胞和大量红系、粒系幼稚细胞等。,骨髓涂片、染色：Wright或Giemsa染色、双染色法,返回,二、骨髓细胞学检查的 内容、方法和临床意义,、低倍镜检查 1、确定骨髓标本的取材和涂片制作是否满意 骨髓穿刺液制成涂片后，肉眼观察，在涂尾部见到散在的约粟粒大小呈浅肉色半透明的骨髓小粒及少量脂肪小滴；在显微镜下见到较多骨髓特有的细胞如各系幼稚细胞及巨核细胞等，是穿刺成功的标志。 如骨髓小粒较少或缺如，骨髓特有成份减少，提示骨髓可能有不同的外周血液稀释，为取材不良 如脂肪滴增多，则表示红髓成份减少，反映骨髓增生减低,插图,2、判断骨髓增生程度（表4-2-7） 骨髓增生程度通常以骨髓中有核细胞的量来反映。 采用五级法,骨髓增生程度分级,下一页,骨髓增生程度分级(高倍镜）,明显减低 15/HP,增生减低 520/HP,增生活跃 2050/HP,明显活跃 50100/HP,极度活跃 100/HP,返回,3、观察巨核细胞 需要注意数量、成熟程度、产血小板功能及其形态（包括血小板的形态）等四个方面。 低倍镜下计数全部片膜的巨核细胞数。并转换油镜观察，进行分类计数，注意巨核细胞及血小板的形态有无异常。 4、注意有无异常细胞 如恶性组织细胞病的异常组织细胞、转移癌细胞、Gaucher细胞、Niemann-Pick细胞等。 注意观察有无散在或成堆分布的体积较大、形态特殊的异常细胞出现，尤其应注意涂片尾部、边缘及骨髓小粒周围。 发现可疑异常细胞，应在油浸镜下观察加以确认。,二、骨髓细胞学检查的 内容、方法和临床意义,、油浸镜检查 选择有核细胞分布均匀、结构清晰、着色良好的涂膜体尾交界处部位作油浸镜检查。 1、有核细胞分类计数 在油浸镜下连续分数200个或500个有核细胞，按细胞的不同系列和不同的发育阶段分别计数。然后计算出分别占有核细胞总数的百分数。再累计粒系和红系总数，计算粒红比例（G:E）。 分类计数时，巨核细胞及分裂、退化细胞不计入。 2、观察细胞形态 仔细观察各系列细胞的形态有无异常，包括注意成熟红细胞的形态有无异常，有无特殊异常细胞出现，必要时还需注意有无寄生虫。,插图,、检查结果的临床意义 1、骨髓增生程度，其临床意义如前表所述。 2、骨髓中各系列细胞及其各发育阶段的比例 粒细胞系统：约占有核细胞的5060% 红细胞系统：约占有核细胞的20% 粒红比例（G/E）2.760.83:1(2-4:1) 淋巴细胞系统：约占有核细胞的20% 单核细胞系统：一般4% 浆细胞系统：一般2% 巨核细胞系统：735个为正常值(1.5*3cm涂片）。 其他细胞：可见到极少量的非造血细胞成分,3、各系列细胞比例改变的临床意义 、粒细胞系与红细胞系比例（粒/红比例） 1)、粒红比例正常：见于：正常骨髓象；粒、红两系平等增多或减少，前者如红白血病，后者如AA；粒、红两系细胞基本不变化的造血系统疾病，如MM、骨髓转移癌、ITP等。 2)、粒红比例增高：指粒/红比例大于5:1。可见粒细胞系增多，或由红细胞系减少所致。常见于：急性或慢性粒白血病； 急性化脓性感染、中性粒细胞性类白血病反应； 纯红再障。 3)、粒红比例减低：指粒/红比例小于2:1。可见粒细胞系减少，或由红细胞系增多所致。常见于： 粒细胞减少，如粒缺；红细胞系增多，如各种增生性贫血、真红或继发性红细胞增多症等。,、粒细胞系统： 1)、粒系细胞增多：见于：各型粒细胞白血病，急性粒细胞白血病以原粒细胞及早幼粒细胞增多为主，CML以中性晚幼粒及杆状核粒细胞增多为主；大部分急性炎症和感染性疾病、中性粒细胞性类白反应等，以中性晚幼粒及杆状核粒细胞增多为主。 2)、粒细胞减少：见于AA、粒细胞缺乏症或粒细胞减少症。 、红细胞系统： 1)红系增多：见于： 各类增生性贫血如溶血性贫血、失血性贫血、小细胞低色素性贫血等，以中幼红及晚幼红细胞增多为主； 巨幼细胞,贫血，以巨幼红细胞增多为主；急性红白血病，以原红及早幼红细胞增多为主，并常伴幼红细胞巨幼样变。 2)、红系减少：见于AA（包括PRCA），但部分CAA，骨髓呈灶性增生者，有时可见红系细胞比例增多。 、淋巴细胞系统： 1)、淋巴细胞绝对性增多：见于急淋和慢淋、恶性淋巴瘤、传淋和传单、其他病毒性感染、淋巴细胞类白等。 2)、淋巴细胞相对性增多：见于AA、粒缺或粒细胞减少症。 、单核细胞系统：增多见于：血液系统疾病如急单、急粒-单、MDS、恶组、淋巴瘤等；某些感染性疾病结核病、布鲁菌病、原虫感染、,感染性心内膜炎等；风湿性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎；其他如恶性肿瘤、肝硬化、药物反应等。 、浆细胞系统：增多见于：MM、浆细胞白血病、巨球蛋白血症、重链病等；反应性浆细胞增多如慢性炎症及感染性疾病、风湿性疾病、恶性肿瘤、过敏性疾病等；AA、粒缺等。 、巨核细胞系统： 1)、增多：ITP、Evans综合征； 骨髓增殖性疾病，如CML、真红、ET、IMF等；脾功能亢进；巨核细胞白血病。 2)、巨核细胞减少：见于AA、AL及其他骨髓浸润或破坏的疾病，以及急性感染、化学物或药物中毒、放射病等。,二、骨髓细胞学检查的 内容、方法和临床意义,、血涂片的观察 在检查骨髓时，需同时进行血涂片的观察 1、应注意WBC分类计数及形态观察； 2、注意成熟RBC的形态有无异常。有核红。 3、估计PLt数量及注意其形态有无异常； 4、观察寄生虫有无（如疟原虫）。 、填写检查报告单 根据骨髓象和血象检查结果，按检查报告单的要求，逐项详细填写及描述骨髓象、血象表现的特征，结合临床资料提出形态学诊断意见。,低倍镜观察（取材 涂片 有核细胞增生 巨核细胞 病理细胞） 油镜观察 骨髓有核细胞分类计数200500个 细胞系形态学观察 粒系 红系 单核系 淋巴系 浆系 其他细胞 计算结果（各细胞系百分比 粒红比值） 观察血片 组织化学染色 填写骨髓图文结果报告单 （骨髓细胞特征 血片细胞特征 组化特征 ） 骨髓片存档保存,骨髓象分析步骤示意图,返回,三、血细胞的细胞化学染色,意义： 1、有助于了解各种血细胞的化学组成及病理生理改变。 2、可用作血细胞类型的鉴别。 3、以及对某些血液病的诊断和鉴别诊断，疗效观察、发病机制探讨等均有一定价值。,（一）过氧化物酶染色（POX）,【原理】 血细胞中的过氧化物酶（peroxidase，POX）能分解试剂中的底物H2O2，释出新生态氧，使无色联苯胺氧化为蓝色联苯胺，后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝黑色的颗粒，沉着于细胞质中。 【结果】胞质中无蓝黑色颗粒者为阴性反应，出现细小颗粒、分布稀疏者为弱阳性反应，颗粒粗大而密集者为强阳性反应。 【临床意义】过氧化物酶染色主要用于急性白血病类型的鉴别。 急性粒细胞白血病时，白血病细胞多呈强阳性反应；急性单核细胞白血病时呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞白血病则呈阴性反应。 因此，POX染色对急性粒细胞白血病与急性淋巴细胞白血病的鉴别最有价值。,骨髓片POX染色,骨髓片POX染色,APL：呈强阳性反应,AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应,AML-M5：呈弱阳性,ALL：呈阴性，3%,（二）苏丹黑B染色,原理：是一种脂溶性的染料，可溶于细胞质内的含脂物质，使胞浆中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒。 结果和意义：与POX染色大致相同。,（三）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP） （Neutrophilalkaline Phosphatase，NAP） 【原理】偶氮偶联法。是血细胞内的碱性磷酸酶将基质液中的-磷酸萘酚钠水解，产生-萘酚与重氮盐偶联形成灰黑色沉淀，定位于细胞质内酶活性所在之处。（另有钙-钴法 略） 【结果】碱性磷酸酶主要存在于成熟阶段的中性粒细胞（分叶核及杆状核），其他血细胞均呈阴性反应。 【参考值】成人NAP阳性率10%40%；积分值4080（分）。,临床意义 1、感染性疾病：细菌感染与病毒感染的鉴别 2、慢性粒细胞白血病的NAP活性明显减低，积分值常为0，类白血病反应的NAP活性极度增高。 3、急性粒细胞白血病时，NAP积分值减低；急性淋巴细胞白血病的NAP积分值多增高；急性单核细胞白血病时一般正常或减低。,4、再障时NAP活性增高；PNH时活性减低。 5、其他血液病时NAP活性中度增高，恶组NAP活性降低。,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）,+,+,+,+,+,+,-,嗜酸粒细胞-,（四）酸性磷酸酶染色（ACP）,原理：（硫化铅法）血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下（PH5.0)将基质中的-甘油磷酸钠水解,产生磷酸钠,然后与硝酸铅反应,生成磷酸铅沉淀,再与硫化铵反应形成硫化铅沉淀,定位于细胞质内。 结果：细胞质内出现棕黑色颗粒为阳性反应；否则阴性(另有偶氮偶联法 略）。,临床意义,1、帮助诊断多毛细胞白血病 2、帮助鉴别T淋巴细胞与B淋巴细胞：TL（+），BL（-） 3、帮助鉴别Gaucher病与Niemanm-Pick病。 4、单核、组织、网状、巨核细胞ACP染色均呈阴性反应。,酸性磷酸酶染色（ACP）,FAB：ALL-L2,ACP染色呈阳性反应（桔红色粗大颗粒）提示为T淋巴细胞白血病,（五）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 粒细胞酯酶,氯乙酸AS-D萘酚酯酶（AS-D NCE,为特异性酯酶）： 1、急性粒细胞白血病呈强阳性，不被氟化钠抑制。 2、急性单核细胞白血病和急性淋巴细胞白血病呈阴性。 3、急性粒-单核细胞白血病时，可见阴性和阳性二种细胞。,（六） -醋酸萘酚酯酶染色,-醋酸萘酚酯酶(-NAE，NSE为非特异性酯酶)： 1、急性单核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病的单核系细胞呈阳性反应，可被氟化钠抑制(抑制率50%)； 2、急性粒细胞白血病一般为阴性或呈弱阳性反应，不被氟化钠抑制。,醋酸萘酚酯染色（ NAE，NSE） 急单呈阳性反应。,（ 七）糖原染色(periodic acid Schiff s reaction PAS ),原理：过碘酸能将血细胞内的糖元氧化，生成醛基。醛基与Schiff 液中的无色品红结合，形成紫红色化合物，定位于细胞质内。 结果 ：胞质中有红色颗粒、团块、均匀红色为阳性。 意义： 红血病、红白血病阳性，其他红细胞贫血阴性，巨核细胞阳性。,临床意义 粒系中原粒cell(-)，早幼粒cell强阳性，中性粒细胞（+），单核（），淋巴（-），少数（），红细胞（-）；巨核、Plt均呈阳性反应。,PAS,AML-M6 幼红细胞呈阳性反应,MA 幼红细胞呈阴性反应,（八）铁染色（普鲁氏蓝反应） 【原理】人体内的总铁有一定量以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存在骨髓中的单核-吞噬细胞系统细胞的胞质内，幼红细胞胞质的线粒体中也含有含铁血黄素。这些铁在酸化的亚铁氰化钾溶液中反应，生成蓝色的铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。 【结果】 1、细胞外铁 观察骨髓小粒中贮存在单核-吞噬细胞系统内的铁。阳性反应为在骨髓小粒上见到呈浅蓝绿色均匀的无形物质，或呈蓝色或深蓝色的小珠状、粗颗粒状或蓝黑色的小块状物质。 2、细胞内铁 观察幼红细胞内的铁。正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞核周围可见到15个呈蓝色细小的铁颗粒。含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼细胞。如含粗大深染的铁粒在10个以上，并环绕细胞核排列超过核周径2/3以上者，称环形铁粒幼细胞。,【参考值】 1、细胞外铁 1+2+，大多为2+。 2、细胞内铁 20%90%，平均值为65%。 【临床意义】 1、缺铁性贫血时，早期骨髓中贮存铁就已耗尽，细胞外铁呈“”。因此，铁染色是目前诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一项可靠和切合临床实用的检验方法。 2、非缺铁性贫血如球蛋白生成障碍性贫血，细胞外铁多增加，常3+4+。 3、铁粒幼细胞性贫血时，铁粒幼细胞增多，并可见到环状铁粒幼细胞。,细胞外铁观察,阳性为蓝绿色沉淀,+ 血色病,+ AA、铁粒幼贫血,+ 感染,+ AA、铁粒幼贫血,+ NBM正常骨髓, IDA,骨髓铁染色（Fe）,MDS-RAS铁染色，图中所指为环形铁粒幼红细胞,表4-2-10几种常见急性白血病的细胞化学染色结果,四、骨髓细胞免疫学分型,细胞免疫分型也称细胞免疫标记（表型）检测，它是用单克隆抗体及免疫学技术对细胞膜表面和/或细胞质存在的特异性抗原进行检测，借以分析细胞所属系列，分化程度和功能状态的一种方法。,骨髓细胞免疫学分型,（一）检测方法 1、免疫荧光法(immunof luoresence technigue) 2、免疫酶染色法 （1）APAAP法 （2）PAP法 （3）ABC法 （二）细胞免疫分型的临床应用 1、有助于识别不同系列的细胞。如识别髓,骨髓细胞免疫学分型,系细胞的抗体有CD13、CD14、CD15、CD32、CD33、CD65、CD91、CD156、CD166等。识别淋巴细胞系列的抗体有：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD19、CD20、CD52、CD77等。识别巨核细胞和血小板的抗体有CD41、CD42、CD61等。识别红细胞系列的抗体常用血型糖蛋白A或B。 2 、识别不同的淋巴细胞 识别成熟T淋巴细胞的抗体有CD2、CD3、CD7、CD8等。识别成熟B淋巴细胞的抗体,骨髓细胞免疫学分型,有CD19、CD20、CD22等。识别NK细胞的抗体有CD16、CD56等。 识别不同的淋巴细胞除检测细胞表面的抗原外，还可以检测细胞表面的受体及细胞表面其他分子，如TCR、MHC等。 3、用于检测T淋巴细胞亚群 临床上常用CD3、CD4和CD8单抗检测全T（CD3）细胞，并可将外周淋巴器官和血液中T细胞分为TH（CD4+，CD8-）和TS（CD4-、CD8+）两个主要亚群，计算TH/TS比值作为,骨髓细胞免疫学分型,机体免疫状态、某些疾病诊断、病期分析、监测治疗和判断预后的参数。 4、用于识别不同分化阶段的细胞 CD34+、CD90+、Lin-被认为是造血干细胞的主要标志；CD34+、CD33+为造血干细胞向髓系定向的标志；CD34+、TDT+、CD10+、CD7+为T淋巴细胞系祖细胞标志；CD34+、CD19+为B淋巴细胞系祖细胞标志。 根据不同抗体组合可T、B淋巴细胞区分为不同分化阶段。（参照表）,骨髓细胞免疫学分型,5、有助于识别不同功能状态的细胞，如记忆T细胞高表达CD45RO、不表达CD45RA。活化T细胞不表达CD45RA，而CD25、CD2、CD45RO、CD54、CD58等均强表达。 6、有助于对不同系列和不同分化阶段的细胞进行分离和研究。用免疫荧光法标记和活细胞可经流式细胞仪或免疫磁珠法将其分离出来，并使对他们的研究成为可能。,骨髓细胞免疫学分型,7、可用于各种白血病细胞的免疫表型分析（见“急性白血病免疫表型特点”一节）。 8、可用于白血病微小残留病的检查 一个完全缓解的白血病病人骨髓细胞中，若出现CD19、CD22、CD10、CD7、CD5、CD13、CD37、CD34等任何一种抗原阳性同时伴有TdT+则诊断微小残留病存在。敏感性可高达10-4水平。 （三）急性白血病细胞免疫表型特点 1、ALL与AML细胞免疫表型特点,骨髓细胞免疫学分型,2、急性淋巴细胞白血病（ALL）免疫表型特点 3、急性髓细胞白血病免疫表型特点 4、免疫学分类对于双表型白血病、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病急变期细胞的分类和诊断也具有重要作用。,ALL和AML的免疫表型,注： a. CD7对少部分（10%）AML可阳性 b. 10%T-ALL病例HLA-DR可阳性表达 c. TdT在少数（20%）AML（M1）阳性 d. TdT对大多数成熟B-ALL是阴性,急性淋巴细胞白血病的免疫表型特点,急性非淋巴细胞白血病的免疫表型特点,免疫组织化学染色,AML-M2（CD33阳性，呈棕黄色沉淀）,免疫分型（流式细胞仪）,AML-M0（CD5、7、10、19、14、36、GlyA阴性） （ CD13、34、38、33、MPO、HLA-DR阳性）,五、细胞遗传学分析,细胞遗传学分析,自从20世纪70年代以来由于染色体分带技术的出现，尤其是高分辨显带技术的应用，细胞遗传学研究在血液学领域内才得以迅速发展，特别是在恶性血液病的研究中不但确定了某些染色体异常与疾病发生、发展、诊断、治疗及预后有密切关系，而且染色断裂点也往往成为寻找癌基因或抑癌基因的标志。 因此血细胞染色体的检查与分析对遗传性血液病和恶性血液病的诊断、分型及病因和发病机制的研究有重要价值，也为遗传咨询、优生优育提供依据。,（一）染色体检查方法,见第十章分子生物学检查中第三节染色体检查。,（二）染色体分析,通常有两个或两以上的细胞分裂相中检出同一条染色体增加或结构异常；有三个或三个以上细胞分裂相中有同一条染色体丢失才能作为一个染色体异常克隆。 1、染色体命名 人体正常细胞有46条染色体，根据人类细胞遗传学命名的国际体制（ISCN），按其长短和着丝粒的位置编为AG 7组，包括122号常染色体及X和Y性染色体；根据显带特点，将染色体划区分布，一般用4个符号表示特定区带，如“8q22”则代表8号染色体长臂2区2带。,（二）染色体分析,2、核型分析及书写 核型是指中期分裂相的全部染色体按Danvers体制排列而成。其格式书写顺序是：染色体数目、性染色体、染色体异常。各项之间以逗号隔开，性染色体以大写的X与Y表示，各染色变异以小写字母表示，见表5-1。一个完整核型书写方法如下：47，XY，+8，t(9;22)(q34;q11)。表示47条染色体，增加了一条8号染色体，第9号与第22号染色体之间易位，断裂点分别在第9号染色体长臂3区4带和第22号染色体长臂1区1带。,（二）