qPCR原理与分析方法.ppt

qPCR系统,从RNA提取到荧光定量,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介,实时定量PCR技术的概念,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时荧光定量PCR技术涉及的概念,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集,扩增曲线,荧光信号的域值（threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,荧光域值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,C(t) value,Ct值,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性,Ct值的重现性,Ct值定量数学原理,理想的PCR反应,XnX0 2n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,Ct值定量数学原理,非理想的PCR反应,XnX0 （1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,Ct值定量数学原理,在扩增产物达到荧光阈值时,XCtX0 （1En）CtM （1）,*,XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M,方程式（1）两边同取对数得：,LogMLogX0 * （1En）Ct （2）,整理方程式（2）：,LogX0 Log M CtLog（1En）,Cycle number,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系,Ct值定量数学原理,LogX0 Log M CtLog（1En）,mRNA表达的研究：如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析 DNA拷贝数的定量：如易位基因的检测 单核苷酸多态性（SNPs）分析 基因型分析：杂合或纯合子 临床检测：病毒感染的定量监测,实时荧光定量PCR技术的应用,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介,非特异性荧光标记： 1.SYBR Green 特异性荧光标记： 2.TaqMan 3.Molecular Beacon,常用荧光标记方法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan方法,TaqMan探针工作原理,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,分子信标(Molecular Beacon),SYBR Green 法,SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图,几种方法的应用比较,起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物,SYBR Green 法的应用,Sample,定量的方法,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),融解曲线分析产物的特异性,融解曲线分析,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,环境要求,模板准备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,仪器介绍,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,数据分析,仪器介绍,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法 绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介,绝对定量简介,标准样品的制备,绝对定量简介,拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v,扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=101/斜率，理论的扩增效率理论值应该为2，即每 一个循环的PCR产物都翻倍，那么2101/斜率，优化的标准曲线斜率应该为3.32 E用每个循环扩增模板百分比表示即：E（E1）100 例如E1.95，那么E（1.951）100，即每次循环有95模板被扩增,扩增效率概念,绝对定量简介,绝对定量举例：HBV病毒检测,Sample: HBV阳性标准品，分别含有5103、5104、5105、5106 copies /ml,实验数据：,绝对定量简介,标准曲线制作举例,扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) 100% =103%,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988,标准曲线制作举例,如未知样本Ct为20.5,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,将Ct值带入线性方程：,20.5= -3.1726 X + 37.52,X=,20.5-37.517,-3.1726,=5.36,QuantityUnknown=105.36 =229087 copies,y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988,内容概要,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介,分析方法： 2 Ct 2 Ct Pfaffi法,相对定量简介,应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化,2Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化,比率（处理后/处理前）2 Ct（处理后）Ct（处理前）2 Ct2 （1618）4,2 Ct法：假设扩增效率（E=101/斜率）为2（即每个循环模板量翻倍）,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),18 16,所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高4倍,2Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,18 16,17 17.4,1.95 1.95,2 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100，且相对偏差不超过5,Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4 Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4 比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2Ct可以修正为：ECt，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95Ct,Pfaffi法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化,实验数据：,Sample,处理前,