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第 27 卷第 5 期农 业 工 程 学 报Vol.27No.5 3782011 年5 月Transactions of the CSAEMay. 2011 茶树油熏蒸处理对香蕉采后炭疽病害的影响 静 玮 1，苏子鹏1,2，朱德明1，韩志萍1 （1. 农业部热带作物产品加工重点开放实验室中国热带农业科学院农产品加工研究所，湛江 524001； 2. 农业部食品质量监督检验测试中心（湛江）中国热带农业科学院农产品加工研究所，湛江 524001） 摘要： 为了探讨植物提取物对香蕉采后病害的防治效果， 以香蕉果实为材料， 采用菌丝生长速率方法测定不同剂量 （0 40 L）的茶树油（TTO）及其主要成分（4- 松油烯醇、 - 松油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素）对香蕉炭疽病菌的离体抗菌 活性，并用 TTO 及其主要成分熏蒸处理接种炭疽病菌的香蕉果实，测定果实常温贮藏（25 C，相对湿度 75%）的发病情 况和 TTO 处理对接种果实防御酶活性的影响。结果表明，TTO、4- 松油烯醇和 - 松油醇均能显著抑制离体炭疽病菌的菌 丝生长，质量浓度越高，抑制效果越明显；1.25 g/L TTO 处理降低了接种炭疽病菌果实的发病程度，0.32 g/L 4- 松油烯醇 和 - 松油醇处理对接种果实病斑直径的抑制效果显著好于 TTO。另外，1.25 g/L TTO 处理提高了接种果实过氧化物酶 （POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的酶活性，抑制了多酚氧化酶（PPO）酶活性。初步研究表明 TTO 熏蒸处理在控制 香蕉果实采后腐烂和提高果实抗病性上具有应用可行性，4- 松油烯醇和 - 松油醇可能是其主要活性成分。 关键词：病害，农产品，熏蒸，香蕉，茶树油，活性成分 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2011.05.066 中图分类号：TS255.3文献标志码：A文章编号：1002-6819(2011)-05-0378-07 静玮， 苏子鹏， 朱德明， 等. 茶树油熏蒸处理对香蕉采后炭疽病害的影响J. 农业工程学报， 2011， 27(5)： 378384. Jing Wei, Su Zipeng, Zhu Deming, et al. Effects of tea tree oil fumigation on banana postharvest disease Colletotrichum musae J. Transactions of the CSAE, 2011, 27(5): 378384. (in Chinese with English abstract) 0引言 果蔬采后和贮运过程中的保鲜问题一直是农产品加 工产业中的一项普遍存在同时难以解决的难点，传统的 保鲜手段主要是依赖化学杀虫剂和杀菌剂的使用1， 但是 随着消费者对一些初加工的果蔬产品食用品质的重视和 有机食品的日益普及，化学添加剂的安全问题及其对环 境的潜在危害不断受到质疑。因而，科研工作者开始研究 寻找其他可行的替代方法，例如生物拮抗、天然植物屏障 以及一些含有低毒性成分的植物源物质2- 3， 它们对真菌都 有一定毒性，单一或结合使用都能起到杀菌作用4。 植物精油是从多种植物组织中提取而来的一种典型 的挥发性物质，也可以成为植物本身的一种病原防御系 统5。植物精油主要包括酯类、醇类、酮类、酚类和萜烯 类等， 可以通过蒸馏和溶解等方式提取得到。 茶树油 （tea tree oil，TTO）原产于澳大利亚东南沿海（沿新南威尔士 州的北部沿海） ，因此又被称作澳洲茶树油。TTO 是一个 商业名称，植物学名称为互叶白千层油。互叶白千层 （Melaleuca alternifolia）是桃金娘科白千层属的一种常 绿小乔木，从其新鲜枝叶中可提取到无色至淡黄色透明 油状液体， 即茶树油6。 TTO 具有良好的光谱杀菌抑菌保 收稿日期：2010- 11- 01修订日期：2011- 05- 10 基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项开放项目（SSCRI 200906） 。 作者简介：静玮（1982） ，女，山西太原人，助理研究员，研究方向： 农产品加工与贮藏。湛江 中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东省 湛江市霞山区人民大道南 48 号，524001。Email: 163 健作用，并有宜人的肉蔻香气，是公认优良的天然芳香 剂、抗菌剂、防腐剂，主要应用在日化、制药、食品等 行业。TTO 含有近 100 种化学成分，基本上是由 50%的 单萜烃和 50%的单萜烃含氧衍射物组成，另有少量的倍 半萜。TTO 的质量主要由其成分 4- 松油烯醇醇和 1,8 桉 叶油素的浓度规定，前者是 TTO 主要的活性成分，具有 紫丁香的花香香气，香气柔和；后者有清凉的草药气味， 往往会使 TTO 带有一定的刺激性气味，影响油的香气， 且多数研究者认为它对人体皮肤产生刺激味，所以其含 量应该越低越好。中国广东、广西、云南等地从 1993 年 起先后成功引种互叶白千层，栽培面积和产量都已形成 规模；国内有关 TTO 的研究也日益活跃，已经初步建立 了中国 TTO 的质量标准和提取方法，但与国外相比7- 10， 国内的相关研究还不足，尤其是在 TTO 的抗菌活性、商 业应用方面的研究报道较少11。 香蕉原产热带亚热带地区，炭疽病是导致该果实采 后腐烂的主要病害之一，在果上多发生于近果端部分， 初出现黑色或黑褐色小圆斑，以后病斑扩大并逐步扩散 至整果，严重影响该果实的产量和品质。本研究主要探 讨 TTO 及其主要成分对香蕉果实炭疽病菌的抑菌效果， 以及对接种炭疽病菌果实的发病情况和抗病性相关酶活 性的影响，为 TTO 在热带果蔬采后保鲜上的应用提供一 定的理论支持。 1材料与方法 1.1试验材料 以广东省湛江市徐闻县生产的巴西香蕉 （Musa. AAA 第 5 期静玮等：茶树油熏蒸处理对香蕉采后炭疽病害的影响 379 Group cv. Brazil ）为材料，在果实成熟度为七八成熟时 采收，采后挑选果形端正、无机械伤和病虫害的蕉指作 试材。采后立即装箱并运回实验室，置于(25 1) C、相对 湿度 75% 5%下贮藏待用。 TTO 原料为湛江市种植的白千层树，经中国热带农 业科学院农产品加工研究所提取获得纯度为 95%的精 油，达到国际标准12。本试验选择了 TTO 及其 4 种主要 成分：4- 松油烯醇、 - 松油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素 （购于四川省宜宾市川汇香料有限责任公司，4 种精油纯 度均为 95%），用于炭疽病菌离体试验和接种病菌果实 的抗病试验。 1.2试剂与仪器 马铃薯葡萄糖培养基（PDA：potato dextrose agar）、 吐温- 20、 氯化钠， 均为国产分析纯。 超净台 （苏州净化） 、 分光测色仪（美国 Xrite）、质构仪（美国 Brookfield）。 1.3试验设计 1.3.1离体试验 参照麻宝成等13的方法，炭疽病菌（Colletotrichum musae）选用从自然发病的香蕉果实上分离的炭疽病菌， 接种于 PDA 培养基上，在 25 C 下培养 7 d 后备用。参照 Plaza 等14的方法，灭菌的 PDA 培养基铺板，待培养基 未凝固时分别加入 0、 10、 20、 30、 40L 的已灭菌的 TTO 用于熏蒸处理，混合均匀后静置凝固，然后从上述培养 好的菌块上取直径 5 mm 的菌块置于平板中央，在 (25 1) C 下分别培养 24、48、72、96 h 后测定菌落直径， 单位以 cm 计；每个处理重复 3 次。TTO 主要成分 4- 松 油烯醇、 - 松油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素的离体抑菌 试验与上述 TTO 的相似。 1.3.2体内试验 香蕉果实用500 mg/L乙烯利浸泡2 min作催熟处理13， 晾干后用2%（体积分数）次氯酸钠溶液浸泡2 min 作消毒 处理15，然后用清水冲洗干净并晾干备用。炭疽病菌 （Colletotrichum musae）选用从自然发病的香蕉果实上分 离的病原菌，接种于 PDA 培养基上，在(25 1) C 下培养 7 d 后用蒸馏水冲洗分生孢子，配置每毫升 1 106个的孢 子悬浮液待用。 用直径 3 mm 的消毒钉子在每个果实近果 柄和近果尾 2 个部位分别刺 2 个 3 mm 深、3 mm 宽的伤 口， 然后在伤口处分别接种 15 L 每毫升 1 106个的炭疽 菌孢子悬浮液，晾干备用。对照组：接种炭疽菌孢子悬 浮液于果实； TTO 处理组： 参照 Szczerbanik 等16的方法， 并根据预备试验的结果，在一定容积的密闭环境中制备 质量浓度为 1.25 g/L 的 TTO 处理环境，然后维持在 (25 1) C 左右，并放入已接种的香蕉果实密闭熏蒸处理 12 h，处理结束后拿出至室温环境下恢复 12 h，然后放入 PE 袋中但袋子不扎口，置于(25 1) C、相对湿度(75 5)% 下贮藏 6 d 后统计伤口病斑直径。TTO 主要成分处理组： 测定茶树油主要成分 4- 松油烯醇、 - 松油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素的抑菌效果。 根据预备试验的结果， 4 种主要 成分的处理质量浓度均为 0.32 g/L，处理方法及统计测定 同 TTO 处理组。 每个处理重复 3 次， 每次重复 20 个蕉指。 1.3.3抗病相关酶测定 按照 1.3.2 中的方法制备对照组和 TTO 处理组果实， 处理后的果实在室温环境下恢复 12h，然后放入 PE 袋中 但袋子不扎口，置于(25 1) C，相对湿度(75 5)%下贮藏 6 d，然后测定贮藏期内 0、2、4、6 d 时果实抗病相关酶： 多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解 氨酶（PAL）和 - 1,3 葡聚糖酶的活性。 1.4测定方法 1.4.1果实伤口病斑直径测定 参考庞学群等17的方法，以病斑扩展垂直 2 个方向 的平均宽度计算病斑直径， 以 cm 计； 每个处理重复 3 次， 每次重复 20 个蕉指。 1.4.2多酚氧化酶（PPO）测定 参照 Chen 等 18的方法并加以改进。取香蕉果皮组织 1.0 g 加 5.0 mL 0.2 mol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH 值为 6.8）（含 5%（质量分数）聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨 匀浆后，15 000 r/min 于 4 C 离心 15 min，上清液用于测 定 PPO 活性，每个处理重复 3 次，每次重复 10 个蕉指， 下同。 反应体系含有 0.5 mL 酶液和 3.0 mL 6.5 mmol/L 邻 苯二酚溶液， 混匀后测定 1 min 内 OD398值变化， 以 OD398 每分钟变化 0.001 为 1 个酶活单位 U， 酶活性表示为 U/g； 酶液蛋白质含量用考马斯亮蓝 G- 250 比色法测定，下同。 1.4.3过氧化物酶（POD）测定 参照 Ippolito 等19的方法并加以改进。提取方法同 PPO。反应系统含有 0.5 mL 酶液、2.0 mL 0.25%（质量分 数） 愈创木酚和 1 mL 0.75% （体积分数） H2O2， 测定 3 min 内 OD470值变化，以 OD470每分钟内变化 0.001 为 1 个酶 活单位 U，酶活性表示为 U/g。 1.4.4苯丙氨酸解氨酶（PAL）测定 参照李合生等20的方法并加以改进。取香蕉果皮组 织 2.0 g 加 4.0 mL 0.1 mol/L 预冷的硼酸- 硼砂缓冲液 （pH 值为 7.8）（每 100 mL 含 3%（质量分数）聚乙烯吡咯烷 酮、 0.037 g 乙二胺四乙酸钠盐和 0.137 mL - 巯基乙醇） ， 冰浴研磨匀浆后，15 000 r/min 于 4 C 离心 15 min，上清 液用于测定PAL活性。 反应系统含有0.1 mL酶液、 3.9 mL 缓冲液和 1.0 mL 0.6 mmol/L L- 苯丙氨酸溶液，对照不加 底物 L- 苯丙氨酸溶液，多加 1 mL 缓冲液；反应液置恒温 水浴 37 C 中保温 1 h 后测定 OD290， 以 OD290每小时变化 0.01 所需酶量为 1 个酶活单位 U，酶活性表示为 U/g。 1.4.5 -1,3 葡聚糖酶测定 参照 Abeles 等21的方法并加以改进。 取香蕉果皮组织 1.0 g 加 5.0 mL 50 mmol/L 预冷的醋酸钠缓冲液（pH 值为 5.0） ， 冰浴研磨匀浆后， 15 000 r/min 于 4 C 离心 15 min， 上清液用于测定 - 1,3 葡聚糖酶活性。反应系统含有 1.0 mL 酶液、2.5 mL 缓冲液和 50L 0.4%（质量分数）昆布 多糖， 反应液置恒温水浴 37 C 中保温 1 h 后， 加入 1.0 mL 3,5- 二硝基水杨酸，混匀后于沸水浴中加热 3 min 终止反 应。将反应液用蒸馏水定容至 10 mL 后混匀测定 OD500， 以加热煮沸 10 min 的灭活酶液作为对照。 以每小时分解昆 布多糖产生 1 10- 9mol 葡萄糖为 1 个酶活单位 U，酶活性 农业工程学报2011 年 380 表示为 U/g。 1.5统计方法 采用 SAS8.2 分析系统软件进行方差分析 （ANOVA） 和邓肯氏多重比较法（Duncan s multiple range test）在 P=0.05 的水平下进行检验。 2结果与分析 2.1TTO 处理对离体炭疽菌的抑制效果 图 1 反映了不同剂量（040 L）的 TTO 处理对香 蕉果实的主要致病菌炭疽病菌活性的抑制效果，剂量 越高抑制效果越明显。与对照组（0 L）相比，TTO 处理 组的病原菌生长在4 d 内全部受到显著抑制（P0.05）；其 中，40L TTO 处理能完全抑制病原菌活性，菌落几乎 完全停止生长； 30L TTO 处理在 48 h 内 100%抑制了菌 落的生长，培养 72 h 后菌落开始生长，但菌落直径显著 低于对照 96.59%（P0.05），直到 96 h 后仍能显著低于 对照 92.42%（P0.05）；20 L TTO 处理能在 24 内完全 抑制菌落生长，48 h 后菌落直径开始迅速增大，但在 48、 72、96 h 内分别显著低于对照 79.07%、69.72%、48.48% （P0.05）；10 L TTO 的抑制效果不及高剂量组，培养 至 96 h 时菌落直径大于对照，但无显著差异，而在 72 h 内能够显著抑制菌落直径的增加（P0.05）。 图 1不同剂量的 TTO 处理对常温下香蕉炭疽病菌的菌落生长 的影响 Fig.1Effects of TTO at different levels on colony diameter of Colletotrichum musae at 25 C. 2.2TTO 主要成分处理对离体炭疽菌的抑制效果 图 2 反映了 TTO 的主要 4 种成分 4- 松油烯醇、 - 松 油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素对香蕉炭疽病菌的离体抑 菌效果。其中图 2a 反映的是 4- 松油烯醇的抑菌情况，与 对照（0 L）相比，2040 L 4- 松油烯醇能完全抑制炭 疽病菌的生长，10 L 处理组的菌落直径在 4 d 内也都显 图 2不同剂量的 TTO 主要成分处理对常温下香蕉炭疽病菌的菌落生长的影响 Fig.2Effects of main components of TTO at different levels on colony diameter of Colletotrichum musae at 25 C. 著低于对照（P0.05）。图 2b 反映的是 - 松油醇抑菌情 况，1040 L 全部 100%抑制了炭疽病菌的活性，表现 出较强的离体抑菌特性。 图 2c 反映的是 - 松油烯的抑菌 情况， 10 和 20 L - 松油烯对炭疽病菌无显著作用效果， 30 和 40 L 处理组的菌落直径在 4 d 内都显著小于对照 （P0.05）。图 2d 反映的是 1,8- 桉叶油素的抑菌效果， 各处理组与对照之间差异不大，30 L 和 40 L 处理组 的菌落直径在 48 h 内显著低于对照（P0.05），但是随 着培养时间延长，菌落迅速生长，1,8- 桉叶油素的抑菌 作用逐渐降低。总体来说，4- 松油烯醇和 - 松油醇这 2 第 5 期静玮等：茶树油熏蒸处理对香蕉采后炭疽病害的影响 381 种成分的抑菌能力要显著高于 - 松油烯和 1,8- 桉叶油 素，与图 1 中 TTO 的离体抑菌能力相比，4- 松油烯醇和 - 松油醇更强，这可能与他们的纯度有关，后 2 种成分 是纯度为 95%的单一精油，而 TTO 则是包含 4- 松油烯 醇和 - 松油醇等具有抑菌活性的成分以及其他多种成 分在内的混合物。 2.3TTO 及其主要成分对接种炭疽病菌的香蕉果实的病 害抑制效果 图 3 反映了 TTO 及其主要 4 种成分对接种炭疽病菌的香 蕉果实的作用效果。 试验表明， 由预试验确定的 TTO （1.25 g/L）及其主要成分（0.32 g/L）的处理剂量能够有效控制 接种果实伤口的发病。在接种后的第 5 天对照和处理组 果实的伤口均开始发病，而 4- 松油烯醇和 - 松油醇的伤 口发病程度则分别低于对照 44.2%和 43.9%（P0.05）； 随着伤口发病的发展，至第 6 天时，TTO 处理组病斑直 径显著低于对照 24.9%（P0.05），4- 松油烯醇和 - 松油 醇处理组分别低于对照 32.9%和 24.9%；第 7 天时 TTO、 4- 松油烯醇和 - 松油醇处理组仍分别低于对照 21.7%、 22.9%和 21.7%，这些表明 4- 松油烯醇和 - 松油醇能够显 著抑制果实伤口病斑直径的不断扩大（P0.05），这与图 2 中的离体抑菌结果一致， 能够通过抑制病菌活力从而控 制果实伤口发病。这与国外学者利用其他植物精油控制 柑橘果实腐烂的结果相似。与本试验利用精油挥发性的 特点而对香蕉果实进行熏蒸处理相似，Liu 等22利用百 里香酚熏蒸接种 M. fructicola 的杏果实和 Chu 等23利用 百里香酚熏蒸处理接种 B. cinetea 的甜樱桃果实均能有效 控制果实发病。 但是 Arras 等24- 27也发现在常压下将精油 T. capitatus 挥发至柑橘果实表面， 然后接种 P. italicum 或 者 P. digitatum 以及 B. cinerea 等都不能起到抑菌作用， 而低压环境下有利于提高百里香酚的处理效率。这些都 对精油的商业应用提出了新的要求。 图 3TTO 及其主要成分处理接种炭疽病菌的香蕉果实后常温 条件下的病斑直径的变化 Fig.3Effects of TTO and its main components on lesion diameter in banana fruit inoculated with Colletotrichum musae at 25 C. 预备试验中发现由于香蕉果实表皮可能对 TTO 比较 敏感，高剂量的 TTO 会导致果皮迅速变色发黑，所以处 理果实的剂量无法和处理病原菌的剂量完全一致，这一 现象在国内外的相关报道并未见详细报道，Plaza 等14曾 指出，提高百里香或肉桂精油质量浓度至 5%方可显著抑 制柑橘果实的青霉菌病害，但是这一高浓度可能会给果 实带来生理毒性；与 TTO 相似，4- 松油烯醇、 - 松油醇、 - 松油烯和 1,8- 桉叶油素也都更易对果实果皮造成伤害， 这些决定了上述 3 种精油的离体试验的处理浓度都要显 著高于处理接种果实的浓度，所以这可能是它们的体内 抑菌效果不及离体试验更加显著的原因，但是无论是离 体试验还是体内试验， 4- 松油烯醇和 - 松油醇都能有效控 制炭疽病菌的生长活性，并降低了接种果实的发病程度， 所以可以认为 4- 松油烯醇和 - 松油醇是 TTO 抑制炭疽病 菌活性的主要活性成分。 2.4TTO对接种炭疽病菌的香蕉果实抗病相关酶活性的影响 图 4a 反映了接种炭疽病菌的香蕉果实经 1.25 g/L TTO 处理后常温（25 C）贮藏 6 d 内的 PPO 酶活性的变 化。对照组的酶活变化不大，但是处理组的酶活却低于 对照，并且两组的差异在贮藏至第 4 天和第 6 天时趋于 显著（P0.05），说明 TTO 在一定程度上抑制了果实的 PPO 酶活。 PPO 与植物的抗病性密切相关， 高活性的 PPO 与形成抑菌的醌类物质和清除自由基有关，而在某些植 物中，这些酶显示较低活性则有利于活性氧的积累，这 对病原菌有直接的杀伤作用，并且通过促进细胞壁的木 质化和结构蛋白的聚合形成最初的防卫屏障28- 29。POD 可催化酚类物质的前体聚合为木质素，从而可以加固植 物细胞壁、抵抗病原物侵袭的作用。图 4b 反映的是接种 果实 POD 酶活性的变化，贮藏初期，两组的酶活性都有 上升，但在贮藏的第 2 天至第 6 天内，处理组的酶活性 都显著高于对照（P0.05），TTO 处理有利于保持较高 的 POD 酶活性，从而利于提高果实的抗病性。PAL 是苯 丙烷类代谢中的关键酶和限速酶，由该途径合成的中间 产物如酚类物质以及木质素和类黄酮类植保素等都是植 物体内一些重要的抗菌物质，研究表明它与许多植物的 抗病性呈正相关30- 31，具有较强抗性的青熟香蕉也具有 较高的 PAL 活性32。图 4c 反映的是接种果实的 PAL 酶 活性的变化，在贮藏前期和末期，TTO 处理组的酶活性 都显著高于对照（P0.05），尤其是后期的上升过程中， 伴随着果实发病程度的加剧，处理组果实的酶活性迅速 升高。病程相关蛋白（pathogenesis- related proteins, PR 蛋 白）与植物抗病性有密切关系，包括几丁质酶、 - 1,3 葡 聚糖酶和过氧化物酶等33。 图 4d 反映的是接种果实 - 1,3 葡聚糖酶活性的变化两组酶活性随着贮藏期的延长而迅 速下降，贮藏前期对照组酶活高于处理组，但是差异不 显著；后期两组的酶活性都很低，但是处理组要显著高 于对照 （P0.05） ， 这对果实抗病性是有利的。 综上所述， 接种炭疽病菌的香蕉果实经TTO处理后具有较高的POD 和 PAL 活性， 这些表明 TTO 对香蕉果实腐烂的控制与这 些酶活性的提高有关。 农业工程学报2011 年 382 注：TTO 质量浓度为 1.25g/L。 图 4TTO 处理对接种炭疽病菌的香蕉果实常温下防御酶活性的影响 Fig.4Effects of TTO on activities of defense- related enzymes in bananas fruits inoculated with Colletotrichum musae at 25 C 3结论 试验结果表明，利用 TTO 熏蒸处理能够抑制常温贮 藏（25 C，相对湿度 75%）香蕉果实主要致病菌炭 疽病菌的菌丝生长，40L TTO 能完全抑制致病菌的生 长；而 1.25 g/L TTO 熏蒸处理有效控制了接种果实的发 病程度，反映了 TTO 在热带果蔬采后保鲜上有一定的应 用潜力，4- 松油烯醇和 - 松油醇可能是其主要活性成分。 同时 1.25 g/L TTO 熏蒸处理提高了香蕉果实的 POD 和 PAL 酶活性，有利于诱导果实的抗病性的提高。TTO 对 香蕉果实常温贮藏下的生理影响及其在商业化中的应用 有待进一步的研究。 参考文献 1Saks Y, Barkai- Golan R. 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