液相色谱方法开发.ppt

液相色谱的应用以及方法开发,提 纲：,一.HPLC的应用 二.方法开发过程 1）选择HPLC检测器 2）方法开发的具体步骤 3）梯度洗脱方法,一.HPLC的广泛应用,据2008年统计，世界上化合物总数多达5000多万种 在全部有机化合物中仅有20左右的样品适用于GC分析 而HPLC可对80左右的有机化合物进行分离和分析,HPLC的广泛应用,HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。,HPLC的应用领域,在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分 碳水化合物 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸 食品添加剂 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素 维生素 污染物 霉菌（黄曲霉毒素 农药残留和兽药残留 多环芳烃（PAHS和亚硝酸,HPLC的应用领域,在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。 在兽药研究中分析应用,HPLC 的应用领域,在生物化学和生物工程中的应用 氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用 醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品,HPLC的应用领域,化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等； 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等 在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测,在无机离子分析中应用 饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析,二.方法开发的过程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,第一步干什么?,想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品,分析时要了解哪方面的情况？,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离(制备)时要了解哪方面的情况？,要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）,1）选择HPLC检测器,对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距,2）方法开发一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值 调节a值改变选择性 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性 调节柱长度改变柱效及分离速度,反相色谱的方法开发,开发过程实例 色谱条件 色谱柱：C18，4.6mm15mm 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：1ml/min,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度,3）液相色谱的方法开发,梯度洗脱法,液相色谱泵,稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑 滞后体积 梯度分析更为关注 目的：在任何情况下保持最高精度,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度：高压混合,高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积,梯度：低压混合,低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理,梯度滞后：系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为14ml（4元泵400l，高压泵150l ）,滞后体积变化的影响,设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性,色谱柱反压变化对梯度实验的影响,without pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 1%,Pump with pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 2%,Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each,梯度洗脱的特点,优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低？,一般流出问题,早流出峰的分离度差. 迟流出峰的峰宽增加而峰高降低. 由于k范围宽，所以分析时间长. 强保留组分造成柱污染.,等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.,Analytical Education Center,H5929A 11-09,梯度洗脱 - 一个解决方案,梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成.,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟,平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。,高效液相经常使用粒径5um 的色谱柱，用过一段时间后，柱压会略有升高，尤其是做中药。常用来洗色谱柱的溶剂为甲醇，当色谱柱用甲醇洗过之后，再用含乙腈的流动相平衡，会使柱压迅速升高，色谱柱渗漏，这是由于甲醇和乙腈汇合产生局部高压。因此，这种情况下，应慢慢升高流速，可以从0.6ml/min开始，一步步的平稳柱压，防止色谱柱漏液。,梯度洗脱装置分两种： 高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂分别输入， 低压梯度：在常压下将两种或多种溶剂先混合，然后用高压 泵将流动相输入到色谱柱中。 梯度洗脱优点： 提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。 在使用梯度洗脱时需要注意的地方： 1.注意各溶剂间的互溶性； 2.对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）； 3.注意梯度变化导致系统压力的变化，防止超出限度。,混合溶剂的粘度常随组成的变化而变化。在梯度洗脱时，常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是，当二者以相近的比例混合时，粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。,4.低压梯度混合后易产生气泡，要注意脱气。一般低压梯度是需要在线脱气机来完成的，因各流路溶剂混合后会产生很多气泡；而高压梯度可不用脱气机脱气。 5. 梯度操作容易出现鬼峰，应作空白试验。空白对照至少做三次。 6.选择梯度操作时，几相之间相变化要尽量小,否则不易平衡。 7.梯度洗脱应选用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。,8.要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。特别要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。 有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。,9.每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，将柱子平衡到初始状态。梯度结束后用初始流动相冲洗，可用1030倍柱容积的初始流动相洗脱色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！柱子再生。（梯度周期）,9.要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这样出峰时间的重现性较好； 10.有机相的比例不是越高越好，只要样品峰能满足要求即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间越长 ；,11.低压混合，流速慢，做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡时间比较长（除非你要测多个成分，比如中药指纹图谱），如果非要跑，一定要尽量减小死体积。,12.梯度淋洗和气相色谱中的程序升温相似，给色谱分离带来很大的方便，它对于复杂混合物，特别是保留强度差异很大的混合物的分离，是重要的手段。但离子色谱电导检测器是一种总体性质的检测器，因此梯度淋洗一般只在含氢氧根离子的淋洗液中采用抑制电导检测时才能实现。 13.初始平衡时间尽量长点,第一针最好不要,每走完一针后的平衡时间尽量一致。(很重要) 14.注意柱子的耐水性如何,如果水相过高,很难做到重现。 18.注意测量的波长,如果接近截止波长,请选用梯度级试剂。,改变流速,5%/min 1 ml/min - 5%/ml,5%/min 2.5 ml/min - 2%/ml,Solvents must be pure or ghost peaks will occur. Make certain the buffer is soluble at final gradient mobile phase composition. Allow time for column reconditioning between runs.,Ghost Peaks,0% MeOH,100%,梯度洗脱的实际考虑,对于下列应用，梯度洗脱可能不适合: 使用强保留添加剂的应用. 离子对色谱应用 在裸硅胶柱上的正相HPLC,Blank ru