TRPC6在高糖所致足细胞骨架F-actin损伤.doc

精品论文trpc6 在高糖所致足细胞骨架 f-actin 损伤中的作用杨贺，赵波，孟可欣，徐佳，廖畅，焦军东5（哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科，哈尔滨 150086）摘要：目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道 6（transient receptor potential channel 6， trpc6) 在高糖诱导的肾小球足细胞骨架纤维状肌动蛋白（f-actin）损伤中的作用。方法 以条件永 生性人类肾小球足细胞为研究对象，分别采用 real-time pcr，western-blot 印迹技术观察高 糖条件下足细胞 trpc6mrna 和蛋白表达的变化,通过激光共聚焦法观察高糖作用下足细胞10细胞内钙的变化，以及利用激光共聚焦检测技术观察高糖条件下足细胞 f-actin 变化。结果 real-time pcr 和 western-blot 实验显示高糖作用下足细胞 trpc6 通道蛋白 mrna 和蛋白表 达明显上调；共聚焦数据数据显示，高糖作用下足细胞内钙明显增多，高糖条件下足细胞f-actin 出现重构，使用 trpc6 抑制剂后有所恢复。结论 高糖诱导足细胞细胞骨架 f-actin发生损伤，且 trpc6 参与高糖所致的足细胞骨架 f-actin 损伤。15关键词：糖尿病肾病；trpc6；高糖；肾小球足细胞中图分类号：r587the role of trpc6 in high glucose-induced podocytesf-actin injury20yang he, zhao bo, meng ke xin, xu jia, liao chang, jiao jun dong(department of nephrology,the second affiliated hospital ,harbin medical university, harbin 150086)abstract: objective to investigate the role of trpc6（transient receptor potential channel 6) inglomerular podocytes f-actin injury induced by high glucose. methods the conditionally25immortalized human glomerular podocytes were cultured and the injury was induced by high glucose. using real-time pcr,western-blot and laser scanning confocal microscope to detect the alteration of trpc6 mrna,trpc6 protein, calcium influx and podocytes f-actin under high glucose, respectively. results after high glucose stimulation, the mrna,protein of trpc6 and calcium influx were up-regulated significantly, laser scanning confocal microscope experiments30indicates that high glucose induced podocytes f-actin reorganization which recovered in part after using trpc6 inhibitor; conclusion trpc6 is involved in high glucose-induced podocytes f-actin injury.keywords: diabetic nephropathy; trpc6; high glucose; glomerular podocytes350引言糖尿病肾病（diabetic nephropathy,dn)是糖尿病严重的并发症，发病率逐年增加，在终 末肾病中所占比例越来越大。关于糖尿病肾病发病机制，人们早期关注的是肾小球基质堆积， 基底膜增厚，肾小球硬化，肾间质纤维化等，然而这仅能解释部分蛋白排泄率和肾小球滤过 率的变化1。近年来研究表明，作为肾小球滤过屏障成分的足细胞在糖尿病肾病发生发展中40起到关键作用2-3。瞬时受体电位阳离子通道 6（trpc6）是瞬时受体电位阳离子通道（trpc）家族中的 一员，是一种非选择性的阳离子通道,在人体各组织、器官和细胞中均有表达。2005 年，winn基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20092307110008）作者简介：杨贺，（1983-），女，博士研究生 离子通道与肾脏病。通信联系人：焦军东，（1968-），男，教授，离子通道与肾脏病。e-mail: - 6 -等4首次报道 trpc6 基因突变导致局灶节段性肾小球硬化 ( focal segmental glomeruloscl erosis, fsgs), 从而揭示了 trpc 通道,尤其 trpc6 与肾脏疾病的密切关系。最近研究发现45trpc6 与足细胞骨架之间也存在联系，体外培养的足细胞 trpc6 高表达则可以引起 f-actin 解聚和重新分布，但是关于 trpc6 与高糖所致的足细胞损伤的研究，目前报道较少。本实 验以体外培养的人肾小球足细胞为研究对象，探讨 trpc6 在高糖条件下致足细胞 f-actin 损 伤中的作用。1材料与方法501.1 材料rpmi1640 培养基(hyclone,usa),高容量 cdna 反转录试剂盒（abi applied biosystems, usa），trpc6 抗体（alomone labs,israel),fluo-3am(molecular probes eugere or,usa)， thapsigargin(tg),1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol(oag),fitc-phalloidin,2-aminoethoxydiphenylborane(2apb)均购自 sigma-aldrieh 公司（st.louis,mo,usa）。551.2 方法1.2.1细胞培养和分组将复苏的足细胞放入 33c,5%co2 孵箱中进行传代培养，培养液成分为 rpmi1640,10% 胎牛血清，以及补充剂（胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠,its）。当细胞生长至 70%-80%融合 时，转至 37c,5%co2 孵箱中使用相同的培养液继续培养 10-14 天，至细胞分化完全，选择60第 5-15 代分化完全的足细胞用于实验研究。实验分组：正常糖组( ng 5. 6mmol/l 葡萄糖)， 高糖组(hg 30 mmol /l 葡萄糖)，以及甘露醇组(m 5.6 mmol /l 葡萄糖 + 24. 4 mmol /l 甘露 醇)，根据实验要求培养不同时间后进行后续实验。1.2.2real-time pcr 检测根据经典的操作规程，提取足细胞总 mrna，用分光光度计测定样本中 rna 的纯度和65含量，使用高容量 cdna 逆转录试剂盒加入 0.5mg 样本配制成 10ul 混合物，放置于逆转录 系统中进行 cdna 合成，然后将 cdna 样本在 abiprism 7500 系统中进行 real-timepcr 实 时定量分析。trpc6 引物序列上游引物：5-gccaatgagcatctggaaat-3；下游引物：5-tggagtcacatcatgggaga-3。在 abiprism 基因分析仪上读取 real-timepcr 数据 结果。701.2.3western blot 检测提取不同组细胞的总蛋白，低温离心后取上清，用 bca 法测定蛋白浓度，每个样本取100ug 蛋白进行样品处理后用 10%sds-page 胶进行电泳，转膜封闭，4c 孵育 trpc6 抗 体及内参 -actin 抗体过夜，洗膜，室温孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗 1h，用红外荧光扫描系统 进行检测，用 odyssey infrared 成像系统进行光密度积分值分析。751.2.4细胞内钙检测足细胞培养于多聚赖氨酸涂层的盖玻片上，70-80%融合后用标准细胞外液冲洗细胞 3次，加入用含 fluo3-am(3um),0.03% f-127 的标准细胞外液 1ml 配置的染料 37c 避光孵育45 分钟。染色后细胞使用共聚焦显微镜观察细胞内钙变化，与 ca2+结合的 fluo3 可以被 488nm处激光激发，可在 525nm 处探测到荧光发射。激光扫描共聚焦显微镜监测胞内游离钙浓度80依赖荧光强度变化，依次加入 1umtg，1.8mmca2+以及 100um trpc6 激动剂 oag。胞内 钙离子浓度(ca2+i)以相对荧光强度表达。1.2.5f-actin 染色足细胞培养于多聚赖氨酸涂层的盖玻片上，用 pbs 清洗后用 4%的多聚甲醛室温固定15 分钟，再用 tritonx-100 进行穿透，pbs 清洗后用 5ug/ml fitc-phalloidin 室温避光染色851h,pbs 清洗后，封片，于激光共聚焦显微镜下观察，拍片。1.2.6统计分析统计分析采用 spss16.0 分析软件进行数据处理，所有数据以 xs 表示，双侧检验以p0.05 判定差别有统计学意义，组间比较采用配对 t 检验。2实验结果90951002.1 高糖作用下足细胞 trpc6mrna 表达升高实时定量 pcr 显示高糖组与正常糖组相比，在 24h 时间点 trpc6mrna 表达高于正常 糖组（p0.05),随着时间延长 trpc6mrna 表达逐渐升高，在 48h 升高更加明显（p0.05),（图 1）。图 1 高糖对足细胞 trpc6mrna 表达的影响，与正常糖组相比*p0.05，*p0.01。fig1 the effect of high glucose on trpc6mrna in podocyte, *p0.05, *p0.01 versus ng.2.2 高糖作用下足细胞 trpc6 蛋白表达水平升高western-blot 结果显示，与正常糖组相比，在 24h 时间点高糖组 trpc6 蛋白表达明显增 高（p0.05）,随高糖作用时间延长，trpc6 蛋白表达逐渐升高，至 48h 升高明显（p0.05）,（图 2）。105110115120125图 2 高糖对足细胞 trpc6 蛋白表达的影响。上图为 trpc6 蛋白表达，下图为相应统计数据。数据用均值标准误表示，n=3。*，与正常糖组相比 p0.05，*，与正常糖组相比 p0.01。fig2 the effect of high glucose on trpc6 protein in podocyte. trpc6 protein level (above),corresponding statistical data (below). data are expressed as mean sem n=3.*p0.05, *p0.01 versus ng.2.3 高糖作用下足细胞钙内流增加在静止的细胞内，ca2+主要通过两种机制进入细胞内，一种是钙池调控钙离子内流（store-operated calcium entry,soce）,另一种是受体介导的钙离子内流（receptor- operated calcium entry,roce）.tg 可抑制内质网钙泵引起钙池被动性排空，从而激活 soce，研究证 实 trpc6 可以被 dag 所激活，使 ca2+通过 roce 进入细胞内。我们用 dag 类似物 oag 检测高糖对足细胞内钙内流的影响。实验结果表明高糖增加 oag 诱导的 roce(p0.05),（图 3）。图 3 高糖对 tg 诱导的 soce 和 oag 诱导的 roce 的影响.a 为单个细胞在实验过程中代表曲线。b,c 为 多次实验统计结果，实验结果表明高糖增加 oag 诱导的 roce(*p0.05,vs 正常糖组，n=5)。fig3 the effects of high glucose on tg-induced soce and oag-induced roce.representative traces (a)and summary data (b,c) showing that high glucose enhance oag-induced roce(*p0.05 versus ng,n=5).2.4 trpc6 参与高糖作用下 f-actin 的重排正常条件培养足细胞，f-actin 经 fitc-phalloidan 染色后，显示 f-actin 被染成黄绿色的 长条细丝状贯穿于细胞全长。经过高糖作用后，细胞形态变圆，细胞内 f-actin 出现断裂重 排，应用 trpc6 非选择性抑制剂 2apb 后，高糖所致的 f-actin 重排有所恢复，（图 4）。130135图4 trpc6 在高糖诱导足细胞 f-catin 重组中的作用(400).在 ng 和 m 组，f-actin 染色显示细胞内肌动蛋白呈明显规律的肌纤维样排列。hg 作用后肌动蛋白明显重排，预孵育 100m 2-apb 改变了这一高糖导致 的形态学变化。fig4 the role of trpc6 in high glucose-induced f-actin reorganization(400).in ng and m groups ,a striking organization of stress fibers were showed.hg lead to reorganization,pretreatment of 100m 2-apb attenuated the morphological changes.1401451501553讨论糖尿病肾病中足细胞出现损伤，表现为足细胞密度数量的减少，足细胞肥大变性及足突 融合消失，足细胞骨架损伤在 dn 疾病发生发展过程中起到重要作用，但是关于足细胞骨架 损伤的机制并不明确。trpc6 是 trp 超家族中的一员，是一种非选择性阳离子通道，winn 等利用免疫荧光首次发现 trpc6 在正常人肾小球和肾小管表达。reiser 等5通过激光共聚 焦进一步证实，trpc6 在肾小球主要表达在足细胞。moller 等6发现在人类非选择性蛋白尿 性疾病如 fsgs、微小病变性肾病和膜性肾病患者中，trpc6 表达显著增加,他们还发现 trpc6 表达增加可致足细胞肌动蛋白骨架分子重排和钙离子重新分布。然而，目前关于 trpc6 在糖尿病肾病足细胞骨架损伤中的作用研究较少。足细胞是一种高度特异性，终末分化细胞，呈线状分布于肾小球基底膜的外部，构成阻 止蛋白漏出的最终屏障，在其分化的成熟阶段，足突与足突相接形成裂孔隔膜7。足细胞功 能的正常维持有赖于足突间的裂孔隔膜蛋白 nephrin、podocin 和 cd2ap 等的正常定位和相 互作用，trpc6 表达于足细胞的细胞体并且与 nephrin、podocin cd2ap 等其它裂隙隔膜蛋 白共同表达于相邻两个足细胞膜结合区域5,8，而且有研究也表明在 nephrin 基因缺失的小鼠 中足细胞裂孔隔膜断裂，trpc6 过表达并且其分布也出现变化，这就表明 trpc6 是位于足 细胞裂孔隔膜上的信号转导复合体的一个组成部分，而这个信号转导复合体对于维持足细胞 正常功能起重要作用。donblier 等研究显示，dn 早期存在 nephrin 表达异常和重新分布9。 新近研究表明在糖尿病肾病活检的患者足细胞中 trpc6 表达升高10。细胞骨架是维持足细胞结构和功能的核心因素，对于足细胞细胞骨架的持续性调节是维 持肾小球滤过屏障的至关重要的因素11。足细胞骨架主要由微丝蛋白，中间丝蛋白，微管 蛋白三种不同的超微结构组成。研究足细胞骨架改变往往以沿足突连续性表达的微丝蛋白 f-actin 作为代表。正常细胞中球状肌动蛋白（g-actin）与 f-actin 不断转换，达到平衡，并且只有聚合态的肌动蛋白才具有生物学作用。siu 等研究发现高糖和糖基化终末产物可导致dn 肾小球足细胞骨架破坏12gracem.mitu 发现高糖作用足细胞后足细胞形态变圆，细胞间160165170175180185190195200205联系减少，f-actin 出现重排13。最近研究发现 trpc6 与足细胞骨架之间也存在联系，体外 培养的足细胞 trpc6 高表达则可以引起 f-actin 解聚和重新分布5。研究表明 trpc6 激活 后可导致钙离子内流增多，进而激活钙离子依赖的磷酸化并且分解裂孔隔膜，改变了足细胞 足突的收缩结构，从而造成滤过系数的变化，最终会导致蛋白尿。本实验使用高糖作用于人肾小球足细胞,应用 real-time pcr 和 western-blot 检测技术表 明，与正常糖组相比高糖组 trpc6mrna,蛋白表达明显增高，细胞内钙离子内流增加。高糖作用后足细胞 f-actin 出现重排，使用 trpc6 抑制剂后 f-actin 改变有所恢复，表明 trpc6参与了高糖诱导的足细胞 f-actin 损伤。高糖导致足细胞 trpc6 表达升高的机制目前还不明确，许多研究表明氧化应激在高糖 引起 dn 的信号通路中起到重要作用14-16，在未来的实验中，我们会探讨氧化应激与 trpc6 通道蛋白的关系。综上所述，高糖能导致体外培养的人肾小球足细胞 f-actin 改变，trpc6 可能在其损伤过程中起到一定作用，具体机制有待进一步研究。参考文献 (references)1 mclennan sv,fishere,martell sy,et al.effect of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activite in mesangial cells;possible role in diabetic nephropathyj.kidney int suppl,2000,77(58);81-872 shankland sj.the podocytes response to injury :role in proteinuria and glomerulosclerosis j.kidneyint,2006,69(12):2131-21473 wolf g,chen s,ziyadeh fn.from yhe periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease :podocyte injury comes of age in diabetic nephropathyj.diabetes,2005,54(6):1626-16344 resier j,polur,moller cc,et al.trpc6 is a glomerular slit diaphragm associated channel required for normal renal functionj.nat genet,2005,37(7);739-7445 winn mp,conlon pj,lynn kl,et al.a mutation in the trpc6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis j.science,2005,308(5729);1801-18046 moller cc,weic,altintas mm,et al.induction of trpc6 channel in aquired forms of proteinuric kidney diseasej.am.soc nephrol,2007,18(1);29-36.7 saleem ma,ohare mj,reiser j et al.a conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression j.curropin nephro hypertens,2006,15(1);1-7.8 mukerjin,damodaran tv,winn mp.trpc6 and fsgs;the latest trp channel nelopathyj.biochim biophysacta,2007,1722(8);859-868.9 doublier s,salvidio g,lupia e,etal.nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence fora distinct role for glycated 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