MMP-9 和 NF-κB 在肺癌组织中的表达及相关性分析.doc

mmp-9 和 nf-b 在肺癌组织中的表达及相关性分析厚银环 1万毅新 21 兰州大学第二医院呼吸科，甘肃兰州（730000）2 兰州大学第二医院呼吸科，甘肃兰州（730000）e-mail:huan 摘要目的 探讨基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9， mmp-9）和核转录因 子（nuclear factor of kappa b ，nf-b）在肺癌组织中的表达及相关性。方法 应用免 疫组织化学法，检测 79 例肺癌组织及 40 例非肿瘤性肺组织标本中 mmp-9、nf-b 的 表 达 ， 并与临床病理因素进行相关性分析。结果 mmp-9、nf-b 在肺癌组织中高表达，阳性率分 别为 69.62%和 65.82%，显着高于非肿瘤性肺组织中的阳性表达 12.50%和 17.50%，( p 0.05) 。mmp-9、nf-b 的表达与肿瘤类型、 tnm 分期、淋巴结转移及组织分化有关 ( p 0.05)。mmp-9 表达与 nf-b 呈 正 相 关（r=0.513，p0.01）。结论 在肺癌组织中存在 mmp-9、nf- b 的高表达，mmp-9、nf-b 的高表达与肺癌的恶性程度及淋巴结转移有关。nf-b 可能 通过上调 mmp-9 的表达及活性促进肺癌的侵袭转移。二者表达的检测有助于肺癌侵袭转移的 判断。关键词肺癌；基质金属蛋白酶-9；核因子b (p65)；免疫组织化学 中图分类号r734.2文献标识码 a肺癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在男性居恶性肿瘤的第 一位，女性居第二位。虽然近年来其诊疗技术取得了长足的进步，但肺癌患者的生存率并未 得到明显提高，肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤致死的主要原因，肿瘤组织及其间质的基 底膜是肿瘤细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障。正常基底膜是由iv型胶原等成分构成，为 一致密的网状结构，固有细胞不能正常通过。mmp-9是降解iv型胶原最主要的酶。nf-b( p65是nf-b活性形式中具有转录激活作用的主要成分)是一类重要的细胞转录因子, 参 与多种细胞增殖, 凋亡相关基因的转录调控。在许多恶性肿瘤的发生及转移过程中发挥了重 要作用。huang 等1研究显示，nf - b 的抑制信号能有效的抑制高转移性前列腺癌pc23 细胞的血管内皮生长因子(vegf) 、il - 8 和细胞外基质金属蛋白酶9 (mmp - 9) 3 种主要 前血管生成分子的表达，减少肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的侵袭、转移，同时还可通过上调 基质金属蛋白酶-9（mmp - 9）的表达活性影响肿瘤的侵袭转移。本实验通过免疫组织化学 法检测nf-b和mmp-9在肺癌组织中的表达，以期更全面地了解它们在肺癌组织中的生物学 作用、及其表达与临床病理特征的关系及二者的相关性。1 资料与方法1.1 资料：标本取自2004年6月-2007年5月兰州大学第二医院、甘肃省肿瘤医院胸外科住院 手术切除及气管镜活检的标本，经病理确诊为原发性支气管肺癌79例，男54例，女25例；年 龄27-73岁，中位年龄57岁。本实验的组织标本中小细胞肺癌（sclc）21例（男14例，女7 例），均为未分化，鳞癌34例（男31例，女3例），高8例，中14例，低12例，腺癌20例（男59例，女11例），高分化5例，中10例，低5例，大细胞癌4例（男3例，女1例），未分化。临床分期:依据2002年国际抗癌联盟(uicc) tnm分期标准，i期16例（ia 4例，ib 12例），ii 期21例（iia4例，iib17例），iii期41例（iiia33例，iiib8例），iv期 1例。有淋巴结转 移组49例，无淋巴结转移组30例。所有患者术前均未接受化疗、放疗和其它治疗。以非肿瘤 性肺组织标本（肺炎18例，肺结核12例，炎性假瘤10例）40例作为对照组，男28例，女12 例，年龄26-68岁，中位年龄46岁。1.2 方法：所有标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成厚4m的切片，采用sp法进行nf- b、mmp - 9免疫组化染色。兔抗人nf-b多克隆抗体、鼠抗人mmp - 9单克隆抗体、sp试 剂盒、dab显色剂均为福州迈新生物技术有限公司产品。免疫组织化学染色按sp试剂盒操作 说明进行，切片常规脱蜡水化后，以柠檬酸盐缓冲液进行高压加热法行抗原修复，用pbs代 替一抗做阴性对照，阳性对照采用已知实验中证实对本实验所用抗体呈阳性染色反应的肺癌 阳性切片。1.3 结果判断：细胞浆或细胞核中见清晰棕黄色颗粒者为nf-b和mmp-9阳性表达细胞。根 据每张切片的阳性细胞显色深浅及阳性细胞比率计分，显色深浅：不显色为0分；浅黄色1 分；棕黄色2分；深褐色3分。阳性细胞百分率：无阳性细胞显色0分；阳性细胞显色25% 为1分；25%-50%为2分；阳性细胞显色50%为3分。二者得分相加：0分为阴性（-）；1-2 分为弱阳性（+）；3-4分为阳性（+）；5-6分为强阳性（+）。1.4 统计学处理：应用spss 11.5统计分析软件，mmp-9和nf-b各组中阳性率的比较采用行列表2 检验，二者之间的相关性用spearman相关分析，检验水准 = 0.05。2 结果2.1 nf-b和mmp-9免疫组织化学染色结果：肿瘤组织中nf -b 和mmp-9蛋白阳性表达呈 棕黄色颗粒状，前者主要位于细胞质，部分位于细胞核。后者弥漫分布于细胞浆，部分位于 细胞核。在正常肺组织中仅见细胞浆中散在分布，细胞核中则无表达。2.1 nf -b和mmp-9在肺癌组织和正常组织中的表达：nf -b和mmp-9在肺癌组织中高表 达，阳性率分别为65.82%和69.62%，正常肺组织中表达较低，阳性率分别为17.50%和12.50%， 二者相比差异显着。（见表1）表1nf -b和mmp-9在肺癌组织和正常组织中的表达组别例数mmp-9nf -b-+阳性率%-+阳性率%肺癌79249291769.62275252265.82正常403550012.503370017.502.2 nf -b、mmp-9表达与肺癌临床病理特征的关系：nf -b和mmp-9的表达与患者的年龄、性别无关（p0.05），而与肿瘤的组织类型、临床分期、分化程度及是否伴有淋巴结转移密切相关，在肺癌组织中nf -b、mmp-9表达在淋巴结转移组、iii-iv期及低分化癌组织中的阳性表达显着高于非淋巴结转移组、i-ii期及高分化组的表达，（p0.05）。（见 表2）表2nf -b、mmp-9表达与肺癌临床病理特征的关系临床病理因素例数nf -bmmp-9阳性例数阳性率%p阳性例数阳性率%p 60493265.30.9023469.40.954 年龄 60302066.72170.0男543564.80.7813972.20.460 性别女251768.01664.0鳞癌342264.72367.6组织学腺癌201050.00.0371155.00.031 类型小细胞癌211781.01885.7大细胞癌4375.0375.0高13538.50.001646.20.007 组织分化中241041.71354.2低423788.13685.7i+ii392051.30.0072256.40.012tnm 分期iii+iv403280.03382.5有493979.60.0014081.60.003淋巴结转移无301343.31550.02.3 nf -b与mmp-9的关系：在肺癌组中，nf -b与mmp-9二者均阳性表达46例，二者均阴 性表达16例，二者呈正相关关系( p0.01， r=0.513)。表3nf-kb与mmp-9的关系名称 mmp-9nf -b+-阳性率%相关系数p+46590.20.5130.01-121642.93 讨论肺癌是当今发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。ginsberg等2报道，经过正规积极治疗的 患者，其五年生存率仅为13%，绝大部分的患者最终死于局部复发或远处转移。从分子水平 了解肺癌侵袭转移的机制，并进一步探索防止肺癌侵袭和转移的办法，是肺癌治疗能否取得 突破性进展的希望所在。mmp是与肿瘤侵袭和转移有关的重要的物质之一，它能降解细胞外 基质的各种蛋白成分。细胞外基质包括基底膜和间质。正常基底膜是一种均一、连续的细胞 外结构，它的主要成分是iv型胶原，iv型胶原酶能特异性地降解基底膜。iv型胶原酶又称明 胶酶，属于mmp中的明胶酶类，其中最重要的是分子量为92kd的mmp-9。研究发现，在多种恶 性肿瘤中存在着mmp-9的高表达。本实验通过免疫组化法测定79例肺癌患者肿瘤组织中mmp-9 的表达，发现肿瘤组织的mmp-9的阳性率明显高于正常组织和良性肺病组织，且其阳性表达 率随着肿瘤病理类型、临床分期的增高以及淋巴结转移的出现而增加，具有显着的统计学意 义。与farias 等3和thomas 等4结论一致，提示mmp-9的表达上调与肿瘤浸润和转移呈正 相关，可作为肺癌恶性程度及判断预后的一个生物学指标。核转录因子nf -b 是1986 年由bltimore 和rwiansen在成熟b细胞中发现的，这种蛋 白能与免疫球蛋白轻链内含增强子的特异性序列结合，所以命名为b5。对nf -b 的 研究已成为当前一个非常引人关注的热点。近来研究表明, nf - b调节许多粘附、侵袭转 移相关因子的转录而参与肿瘤的侵袭转移6 。正常细胞内nf -b 活化时间很短。 shishodia等7通过研究发现正常细胞在给予烟雾刺激后，细胞内的nf -b活化时间延长， 可持续24 h以上，远远超过正常细胞内nf -b活化时间，且活化强度与烟雾的接触剂量和 时间明显相关。anto等8在用烟雾的冷凝集物刺激肺细胞时发现受刺激细胞内ib 激酶活 化 ， nf-b-ib 复合体中ib被降解，nf -b活化增强进入细胞核内。研究还发现 9,10， 活化的nf-b 可以促进肿瘤转移相关因子如基质金属蛋白酶(mmp) 、纤溶酶原激活物尿激 酶( u-pa)等的表达。silva等 7 发现在肿瘤细胞中伴随有nf-b持续活化的u-pa高 表 达 。 nf-b 作为mmp的转录调控因子，其在与mmp启动子上- 615、- 600位点的b序列结合后使 mmp的分泌明显上调。多项实验表明，在肺癌组织中nf -b的表达显着高于正常肺组织。nf - b 在多种肿瘤细胞株及肿瘤组织中持续活化，多种因子通过nf-b持续活化参与肿瘤的进 展11。 在肿瘤发生的实验性研究中，nf -b的组成性激活与致瘤性转化有关12 。我们在实验中发现：人肺癌组织细胞胞质与胞核中nf-b 的蛋白表达为阳性，而正常 肺组织弱表达，并且癌组织蛋白表达较正常组织明显增高探其原因可能是细胞受多种因素刺 激，诱导了nf -b 的活化，nf-b 进入细胞核，与细胞核内特定的dna片断结合，促进转 录。同时还发现，nf -b的表达与肿瘤患者的发病年龄、性别无关，与肿瘤的大体类型也 无关，但与肿瘤的组织学类型有关，小细胞肺癌和大细胞肺癌这两类恶性度比较高的肿瘤中 nf -b的表达较腺癌和鳞状细胞癌增高；nf -b在肿瘤的不同时期表达也不一致，中晚期 较早期明显增高，这说明nf -b的活化也许是肿瘤的晚期事件，它被活化后进一步促进了 肿瘤的恶性进展；伴有淋巴结转移的肿瘤组织较无淋巴结转移组织增高，这说明nf-b参与了肿瘤的浸润转移。nf -b (p65) 造成肺癌侵袭能力增强的作用机制可能是通过nf -b (p65) 的激活，活化许多与浸润、转移相关的重要因子： 包括血管内皮生长因子(vegf)、基质金属蛋白酶(mmp)、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂(u-pa ) 和细胞黏附分子( icam -1) 等。可以说nf -b 的活化是肿瘤发生发展、获得浸润转移恶性表型的关键。 目前以nf -b作为肿瘤治疗新标靶的研究正在进行，在体外实验中取得了一定成效，所以 对nf -b的深入研究将会对肺癌的诊断、治疗及预后判断提供新的思路。本研究结果表明，mmp-9 与肺癌的侵袭转移密切相关，而且nf -b与mmp-9表达呈正相 关关系， 提示在肺癌中mmp-9 的高表达可能与nf-b有关，推测当nf -b 激活后，发挥 基因调控作用，增强了mmp-9基因的转录活性，使mmp-9 表达上调，导致癌细胞的侵袭转移。 nf -b和mmp9 表达的检测有助于肺癌侵袭转移的判断。参考文献 1 oshiro mm,watts gs ,wozn iak rj ,et al .mutant p53 and aberrant cytosine methylat ion cooperate to silence gene expressionj . oncoqene , 2003 ;22 (23) :3624 - 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