蛋白质免疫印迹技术.ppt

实验二 蛋白质免疫印迹技术,一、免疫学,研究抗原物质的结构和功能； 免疫应答产物的结构和功能； 抗原刺激机体产生免疫应答的规律。,免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。 随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。,淋巴组织,免疫活性细胞,免疫活性介质,免疫系统功能的生理和病理表现,功能名称 生理功能 病理表现,免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强） 免疫缺陷病（弱） 免疫自稳 清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病 免疫监视 清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞 感染,当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。 机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。,免疫应答的类型 （一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。 （二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）,抗原和免疫原性,抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。 常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。 抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity）和免疫反应性（immunoreactivity）。 免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。 免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。,抗原的分类,抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原(incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。,抗体的种类,抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。 免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE。 人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较少， IgD和IgE微量。,抗原抗体反应（antigen-antibody reaction） 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。 体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用； 体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologic reaction）。,二、印迹法（blotting）,印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern 印迹法。 人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,三、蛋白免疫印迹的应用,免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。 具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。 是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。,蛋白质免疫印迹检测技术,一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器 四、操作步骤 五、实验结果与分析 六、思考题,一、实验目的,学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Westernblotting的基本原理 熟悉Westernblotting的实验操作,二、实验原理,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备 第二部分 Westernblotting 检测抗血清,将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备,（一）多克隆抗体的概念,抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。,抗体的结构,（二）用于免疫的动物,由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。,动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。 一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。,（三）抗原,抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。 为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。,（四）免疫途径,免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL左右。 实验中0.2mL，34点注射。,皮下注射,（五）佐剂,应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。,佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。 目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。,福氏佐剂（Freund adjuvant）, 通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。 在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。,（六）免疫方法,抗原剂量，首次剂量为1050g，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。 每23周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23mL血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。,抗体的产生顺序与丰度,（七）抗血清的采集与保存,取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。 收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。,（八）抗血清质量的评价,在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。,效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。 某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。,单向扩射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。 如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000 制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。,双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。,双向免疫扩散,免疫扩散试验 1抗原；27为不同稀释倍数的抗体,分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结果显示,探 针 制 备,第二部分 Westernblotting 检测抗血清,Western Blot原理,将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上； 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应； 洗涤去除没有结合的特异性抗体后； 加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体； 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。,免疫印迹的实验包括五个步骤： 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。,一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。 二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。 底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。,三、实验仪器,动物的常规免疫 Westernblotting 检测抗血清,动物的常规免疫,注射器 蜗旋混合器,四、操作步骤,动物的常规免疫 Westernblotting 检测抗血清,抗原的提取与制备 1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶） （周四下午）。,动物的常规免疫,苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠,初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠 （1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态 （2）用酒精棉球消毒待注射部位 （3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫,加强免疫：初级免疫后两周进行。 取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。 加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠 （1）用酒精棉球消毒待注射部位 （2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。 第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。 第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-20以下冰箱保存。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDSPAGE,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,转移电泳设备,Westernblotting 检测抗血清,转膜,半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转1030min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。,封闭,脱脂奶粉（5） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3