乙烷硒啉对小鼠体内移植性肝癌(H22)和Lewis肺癌的抗肿瘤作用.doc

乙烷硒啉对小鼠体内移植性肝癌 (H22)和Lewis肺癌的抗肿瘤作用【摘要】 目的 观察乙烷硒啉对小鼠移植性肝癌(H22)和Lewis肺癌的抗肿瘤作用，并探讨其可能的抗肿瘤机制。方法 建立小鼠体内移植性肝癌(H22)和Lewis肺癌模型，每种属60只，分别设为5组：阴性对照、阳性对照(CTX)和乙烷硒啉3个剂量组，每组12只。于接种肿瘤第2天至第8天5组分别连续腹腔注射5g/L羧甲基纤维素钠溶液、60mg/kg CTX及25、12.5、6.3mg/kg乙烷硒啉。停药3d后(第11天)每组处理一半动物，计算抑瘤率，并用流式细胞仪观察其对细胞周期的影响；另一半动物观察生命延长率。结果 乙烷硒啉在25、12.5、6.3mg/kg剂量下对小鼠肝癌H22移植瘤的抑瘤率分别为52.5%、43.6%和30.2%，生命延长率分别为56.6、38.7%和14.2%；对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率分别为43.8%、29.6%和18.9%，生命延长率分别为47.3%、17.9%和6.3%。乙烷硒啉各剂量组肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)，且25.0mg/kg组出现S期阻滞(P<0.05)。结论 乙烷硒啉对小鼠移植性肝癌(H22)和Lewis肺癌具有抗肿瘤作用，且随剂量的增加其抑制肿瘤作用显著增强。其抗肿瘤作用可能是通过诱导细胞凋亡，同时干扰肿瘤细胞生长周期，导致S期阻滞而实现的。 【关键词】 乙烷硒啉；H22肝癌株；Lewis肺癌株；流式细胞仪ABSTRACT: Objective To observe the antitumor effect of ethaselen on transplanted liver cancer (H22) and Lewis lung cancer mice. Methods The transplanted liver cancer (H22) and Lewis lung cancer mice models were established. Each genus consisted of 60 mice, which were divided into control, CTX, and three ethaselen dose groups, respectively, with 12 mice in each. Intraperitoneal injection (ip.) of three dosages was performed once a day through the abdominal wall separately, from the second to the eighth day after cancer was transplanted. On the eleventh day, six mice in each group were killed to calculate the tumor inhibition ratio and observe the cell cycle by flow cytometry, and the others were observed for the life extension ratio. Results When ethaselen was given at the dosage of 25, 12.5 and 6.3mg/kg, the tumor inhibition ratio was 52.5%, 43.6% and 30.2%, and the life extension ratio was 56.6%, 38.7% and 14.2% in the transplanted liver cancer (H22) mice, respectively. The tumor inhibition ratio was 43.8%, 29.6% and 18.9%, and the life extension ratio was 47.3%, 17.9% and 6.3% in the transplanted Lewis lung cancer mice, respectively. Compared with that of the control, the apoptosis ratio was obviously increased in each group, and there was obviously induced S phase arrest in 25.0mg/kg (P<0.05). Conclusion Ethaselen has an antitumor effect on the transplanted liver cancer (H22) and Lewis lung cancer mice, and as dosage is increased, the effect is enhanced. The mechanism may be accomplished through interfering tumor cell growth cycle, S phase arrest and apoptosis. KEY WORDS: ethaselen; H22 liver cancer cell line; Lewis lung cancer cell line; flow cytometry 硒作为一种微量元素，其抗癌作用已被广泛研究12。硒在自然界以有机硒和无机硒化合物两种形式存在。实验证明，无机硒化合物具有蓄积性毒性和致突变作用，而有机硒化合物因为其经过甲基化、烷基化等脱毒过程，不仅具有抗癌作用，且毒性与无机硒化合物比较显著降低34。本研究以肝癌(H22)和Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，观察有机硒化合物乙烷硒啉的抗肿瘤作用，并探讨其可能的抗瘤机制。 1 材料与方法 1.1 受试药物及仪器 乙烷硒啉(ethaselen)为浅黄色粉末，不溶于水，由北京大学药学院提供,批号040601；用5g/L羧甲基纤维素钠溶液制成10g/L的储备液，高压灭菌，-20保存备用，使用前稀释到所需浓度。环磷酰胺(CTX)由齐鲁制药厂生产，5g/L羧甲基纤维素钠溶液配成2g/L的储备液，-20保存备用，用前稀释到所需浓度。其他均为国产分析纯试剂。倒置显微镜(OLYMPUS, Japan)，回旋式切片机(上海仪表厂)，流式细胞分析仪(FACSCAN, USA)。 1.2 实验动物 ICR种小鼠，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(陕)2007001；C57BL/6种小鼠，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心，动物质量合格证号：京动管许字(2000)第017号。实验动物均为清洁级，每品系各60只，雌雄各半，体重1822g，自由进食饮水。动物在西安交通大学医学院实验动物中心SPF动物房饲养。 1.3 瘤株 H22肝癌、Lewis肺癌为本实验室传代保种的腹水型瘤株。 1.4 方法 1.4.1 H22肝癌、Lewis肺癌(LLC)皮下移植瘤动物模型的建立 实验前复苏瘤株，用低渗缓冲液裂解红细胞5，1000r/min离心3min，沉淀用PBS洗一遍，重新用PBS悬浮，台盼蓝拒染法计数活细胞数，细胞存活率应大于95%。调整细胞密度为5106/mL，每只实验动物颈背部注射细胞悬液0.5mL。待肿瘤长到直径为67mm时，剥离肿瘤，按上述方法在体内传代3次，第3代荷瘤鼠作为皮下移植瘤动物模型进行实验。 1.4.2 实验分组 取ICR种和C57BL/6种小鼠各60只，1822g，、各半。于右腿背部皮下接种H22及Lewis肺癌细胞悬液0.5mL/只。接种后将小鼠随机均分为5组：乙烷硒啉高、中、低剂量组(25、12.5、6.3mg/kg)、阴性对照组及阳性对照组，每组12只。 1.4.3 抑瘤率实验 接种肿瘤后第2天开始腹腔注射新鲜配置的药物或5g/L羧甲基纤维素钠溶液。阳性对照组腹腔注射阳性对照药物CTX 60mg/kg，阴性对照组腹腔注射5g/L羧甲基纤维素钠溶液。以上各组动物每天给药1次，连续7d。每天观察小鼠状态，测量肿瘤大小。每组中随机挑6只动物，停药3d后，于第11天脱臼处死，称体重、实体瘤重, 计算抑瘤率；测量肿瘤的长短径，计算肿瘤体积。其他小鼠任其自然死亡并记录存活天数，计算各组小鼠荷瘤后平均存活天数和生命延长率。肿瘤体积(V)=ab2/2，a为肿瘤块长径，b为肿瘤块短径；抑瘤率(%)=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重100%；生命延长率%=(实验组平均存活时间-对照组平均存活时间)/对照组平均存活时间100%6。 1.4.4 细胞周期分布及凋亡率的检测 避开坏死的部分，剪取乳白色或粉红色肿瘤块，按方法1.4.1分离单细胞悬液，低渗裂解红细胞，调整细胞密度为106/mL；取1mL细胞悬液，加入70%(体积分数)乙醇5mL重悬，4固定30min；固定好的细胞用PBS(pH7.2)洗3次，重悬于1mL PBS中，用300目的细胞筛过滤，上流式细胞仪检测前用50mg/L的碘化丙锭染液染色。流式细胞仪检测后用ModFitLT软件分析细胞周期分布和凋亡率。实验重复3次。 1.5 统计学处理 数据均以s表示，应用SPSS11.0统计软件分析。样本之间的比较用单因素方差分析，S期比率、凋亡率比较采用U检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 乙烷硒啉对小鼠肝癌H22及Lewis肺癌的抗肿瘤作用 乙烷硒啉在25、12.5、6.3mg/kg剂量下对小鼠肝癌H22移植瘤的抑瘤率分别为52.5%、43.6%和30.2%；对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率分别为43.8%、29.6%和18.9%(表1)。 2.2 乙烷硒啉对肝癌H22及Lewis肺癌荷瘤小鼠存活期的影响 乙烷硒啉25、12.5、6.3mg/kg剂量下，H22肝癌细胞荷瘤小鼠的生命延长率分别为56.6%、38.7%和14.2%；Lewis肺癌荷瘤小鼠的生命延长率分别为47.3%、17.9%和6.3%(表2)。 2.3 乙烷硒啉对肝癌H22及Lewis肺癌细胞增殖周期的影响 乙烷硒啉各剂量组和CTX组肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)，且25mg/kg组出现S期阻滞，与对照组比较有统计学差异(P<0.05，表3)。表1 乙烷硒啉对小鼠肝癌H22、Lewis肺癌的抗肿瘤作用表2 乙烷硒啉对小鼠肝癌H22、Lewis肺癌荷瘤小鼠存活期的影响表3 乙烷硒啉对小鼠肝癌H22、Lewis肺癌细胞凋亡的影响 3 讨 论 目前，抗肿瘤药动物实验研究的直接目标主要是观察抑制移植瘤小鼠肿瘤的生长和侵袭状况。本研究从观察乙烷硒啉拮抗肿瘤生长及侵袭状况入手，对接种肿瘤后瘤体血供、浸润、黏连状况连续观察。结果发现，乙烷硒啉组与阴性对照组比较瘤体明显缩小，肿瘤黏连、浸润明显减弱，且肿瘤部位血管较少；乙烷硒啉可明显推迟荷瘤小鼠最早出现死亡时间，且荷瘤小鼠存活期、生命延长率均显著高于阴性对照组；随乙烷硒啉剂量的升高其对肝癌H22及Lewis肺癌的抑瘤率均显著增加。 上述结果提示，乙烷硒啉能够明显抑制荷瘤鼠肿瘤的生长速度及对周围组织的浸润，且有明显剂量依赖性。这可能是乙烷硒啉可作为肿瘤新生血管生成的抑制剂，可促进体内快速产生抗肿瘤新生血管生成的抑制因子，抑制肿瘤新生血管网的形成与发展，从而切断肿瘤细胞的营养供应与代谢通路，使肿瘤生长和浸润减缓，通过抗血管形成的作用7，实现抑制瘤体的生长、浸润和黏连的作用，延长荷瘤鼠生命周期。 流式细胞仪分析细胞凋亡结果显示，乙烷硒啉可提高肿瘤细胞的凋亡率，且随乙烷硒啉剂量增加，肝癌H22及Lewis肺癌的细胞凋亡率增强。同时研究显示，乙烷硒啉25mg/kg剂量组可使肿瘤细胞出现明显的S期阻滞。文献报道，参与引发细胞凋亡的蛋白酶种类很多，其中Caspase家族成员与细胞凋亡密切相关。其中Caspase8在细胞凋亡中发挥启动作用，Caspase3处于内外源性凋亡途径的中心环节，是引起细胞凋亡蛋白酶级联反应的核心蛋白酶，活化后的Caspase3，可激活核酸内切酶，促进行成凋亡小体，在细胞凋亡中起着重要作用8；同时细胞生长周期紊乱，直接影响细胞繁殖9。提示乙烷硒啉抑瘤作用可能是通过活化Caspase3，而诱导其细胞凋亡，同时使肿瘤细胞生长周期紊乱，导致S期阻滞实现的。【参考文献】 1崔乔，尚德静，邹霞. 硒化合物的抗癌作用 J. 中国生化药物杂志, 2004, 25(4):247249.2俸家富. 硒蛋白和硒的抗癌机理 J. 微量元素与健康研究, 2001, 18(1):7072.3朱茂祥，杨华，龚话芬. 不同硒化合物抗肿瘤作用的研究 J. 微量元素与健康研究, 2000, 17(2):1416.4牟维栩. 不同化学形式硒的毒性作用机制 J. 国外医学卫生学分册, 2001, 28(4):202205.5王怡瑞，肖军军，董晓敏，等. 双硒唑烷1的动物体内抗肿瘤作用 J. 北京大