中期因子在急性髓系白血病患者的表达及临床意义.doc

中期因子在急性髓系白血病患者的表达及临床意义 作者：杨琳，董作仁，潘崚，罗建民，徐世荣【摘要】 为了探讨中期因子(midkine，MK)与急性髓系白血病(AML)患者预后的关系，本研究采用半定量RT-PCR方法检测65例M患者与15例正常人骨髓单个核细胞(MNC) MK、bcl-2 mRNA的表达，并对20例AML患者和5例正常人采用Western blot检测MNC中MK基因的表达。结果显示：初治组、复发组和化疗缓解组MK基因表达水平分别为0.3310.436，0.3740.463和0.0670.190，正常人MK基因表达阴性；MK基因表达阳性与表达阴性患者的首次完全缓解（CR）率分别为63.16%和93.55%（P=0.01），MK基因表达阳性患者的复发率（100%）明显高于表达阴性者（40%）（P=0.019）；多药耐药组与药物敏感组MK基因的表达率分别为57.69%和25.64%（P0.01）； MK与bcl-2基因表达呈正相关（r=0.556，P<0.001）。结论：AML患者白血病细胞可以产生MK，且MK阳性率的高低与AML病期相关，是影响AML患者近期预后的重要因素之一。MK可能通过上调bcl-2的表达抑制白血病细胞凋亡。 【关键词】 急性髓系白血病Expression of Midkine in Patients with Acute Myeloid Leukemia and Its SignificanceAbstract The study was aimed to investigate the expression of midkine (MK) in bone marrow mononuclear cells (BM MNC) from 65 acute myeloid leukemia patients and 15 normal controls. The method of RT-PCR was used to examine the expression of MK mRNA in BM MNC. Parts of samples were incubated for 24 hours and the gene expression of MK in the BM MNC was detected by means of Western blot. The results showed that the expression of MK of BM MNCs in 50 newly diagnosed AML patients (0.3310.436) and 15 AML patients in relapse （0.3740.463）were markedly higher than that in 15 CR cases (0.0670.190)，and 15 normal controls（0），respectively. The complete remission in MK positive patients （63.16%）was significantly lower than that in MK negative group（93.55%）. The patients with positive MK expression had a higher relapse rate than those with negative MK expression. The positive rate of MK gene expression in drug-resistant patients and drug-sensitive patients were 57.69% and 25.64% respectively and there was positive correlation between the gene expressions of MK and bcl-2 （P0.01） (r=0.0556，P<0.001). It is concluded that MK can be secreted by AML cells and involved in drug-resistent，its positive expression may be associa-ted with the poor prognosis in newly diagnosed AML patients. The inhibitory effect of MK on apoptosis of leukemic cells is induced by upregulating bcl-2 expression.Key words acute myeloid leukemia； midkine； prognosis中期因子(midkine，MK)基因是近年来新发现的肝素结合性生长因子，其多种生物学活性与癌有关。近几年国外研究报道，MK在多种人类肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤发病过程1-3。在髓系白血病细胞株中发现MK的异常表达，它可能参与白血病的发生、发展4。对AML患者表达情况的临床研究目前尚未有报道。我们分别应用RT-PCR和Western blot 检测了初治组、化疗完全缓解组、复发组AML患者MK基因与蛋白表达水平的变化，探讨MK表达与AML的近期预后和细胞凋亡的关系，推断其在AML发病中的可能作用。材料和方法病例65 例 AML 患者包括 50 例初治患者，15 例复发患者，15 例健康志愿者作为正常对照。 患者均符合FAB诊断标准5，其中M1 1例、M2 12例、M3 19例、M4 15例、M5 17例、M6 1例。男36例，女29例，中位年龄为32（14-64）岁。15例健康志愿者中男9例，女6例，中位年龄35（18-55）岁。髓系细胞株K562、HL-60由中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心提供。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）应用TRIzoL提取BMMNC的总RNA，然后逆转录成cDNA并进行PCR扩增。MK上游引物：5-CCA GGCTTGGCGTCTAGT-3，下游引物：5-ATGCAGCACCGAGGCTTCCT-3，扩增产物445 bp。bcl-2的上游引物：5-CAACATCACCTATTGGATCC-3，下游引物：5-CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3，扩增产物318 bp。由对照GAPDH的上游引物：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGATA-3，下游引物：5-AGCCTTCTCCATGGTTGGTGAACAC-3，扩增产物374 bp。扩增条件：对MK，94变性45秒，60退火1分钟，72延伸2分钟，35个循环；对bcl-2，94变性60秒，61退火50秒，72延伸50秒，30个循环。对GAPDH，94变性40秒，55退火60秒，72延伸60秒，20个循环。取4 l扩增产物，同时加入4 l GAPDH 扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙啶），90 V，45分钟，Eagle Eye读胶仪扫描定量，以MK/GAPDH、bcl-2/GAPDH的比值作为其mRNA相对表达水平。细胞孵育随机选取20例急性髓系白血病患者（包括复发患者2例，缓解期患者2例），5例正常人，分别无菌抽取骨髓5 ml，无菌条件下以淋巴细胞分离液（密度1.077）分离单个核细胞，用RPMI 1640培养液洗2遍，以5106/ml的接种密度将细胞接种于RPMI 1640培养液中（无血清），于细胞培养箱中孵育24小时（孵育条件：温度37，CO2 5%）。孵育后1 200g离心5分钟分离细胞和培养液，用部分细胞提取总RNA，用RT-PCR方法检测MK mRNA（方法同前）；并取1107细胞进行裂解，成匀浆后取上清液（相当于3 mg组织蛋白）用于Western blot分析。Western blot分析取15 l匀浆后的上清液与15 l上样缓冲液充分混匀后进行10% SDS-PAGE电泳，并转印至PVDF膜上，膜用1% BSA和0.05% Tween 20封闭1.5小时，抗MK单克隆抗体（1100稀释）4过夜，过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小时，DAB显色并照相。临床耐药标准4一线药物诱导治疗无效；第一次诱导缓解后6个月内复发；第一次诱导缓解后6个月后复发再次诱导治疗无效；2次或2次以上复发者。按照该标准将65例患者分为多药耐药组和药物敏感组，其中多药耐药组26例，药物敏感组39例。临床治疗方案对初治AML（M3除外）患者采用DA方案（阿糖胞苷、柔红霉素）化疗诱导缓解。对复发AML患者分别采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙苷）、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素）等方案。M3患者采用全反式维甲酸（ATRA）或以ATRA为主，联用小剂量DA、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯碱）方案诱导分化或ATRA加As2O3治疗，复发M3者应用As2O3治疗或标准化疗。统计学处理SPSS 10.0统计软件分析处理，采用t检验、 2检验及四格表确切概率法。结果AML MK mRNA表达及其与FAB分型的关系因M1、M6、M7病例数少或缺如，在方差分析时去除。本研究只分析了M2、M3、M4、M5 4种类型患者中MK的表达，应用方差分析，P0.05，由此认为4种类型患者MK表达不具有统计学差异。正常人及AML患者MK mRNA和蛋白的表达AML患者MK基因的阳性表达率及平均表达水平见表1。同等扩增条件下，15例正常人均未检测到MK基因阳性表达。初治组、复发组MK基因表达率及表达水平明显高于缓解组（P0.05）。初治组与复发组相比，无显著性差异（P0.05）。所有MK蛋白与其mRNA表达相平行（图1、2）。Table. Expression of MK mRNA in newly diagnosed AML，relapsed AML，AML-CR and normal control （略）MK表达与AML临床疗效的关系按MK表达情况将50例初治AML患者分成两组，MK阳性组CR率为63.16%（12/19），MK阴性组CR率为93.54%（29/31），两组差异有显著性(P=0.010)，MK表达阴性组的化疗疗效比阳性组高；对其中35例CR患者进行15个月的随访，随访终点为复发或死亡，其中5例MK阳性患者均在1年内复发，30例MK阴性患者中有12例复发，其无病存活率为60%，两组差异有显著性（P=0.019）。将65例AML患者分为多药耐药组和药物敏感组，多药耐药组MK mRNA的表达率和平均表达水平明显高于药物敏感组 (P<0.01)。MK mRNA表达与 bcl-2之间的关系为研究MK与bcl-2的关系，我们对65例AML患者进行bcl-2 mRNA水平检测，采用直线相关分析发现MK基因表达与bcl-2呈正相关（r=0.555，P0.05）。结果见图3。肝素结合性生长因子对于肿瘤形成有重要作用。MK是近年来发现的一种新的肝素结合生长/分化因子家族成员之一，其结构明显不同于其它已知的生长因子，但生物学活性类似FGF。在小鼠胚胎形成中期，MK mRNA高度表达于多种组织，成年后除肾脏继续表达外，其他所有正常组织几乎测不出MK mRNA表达。有研究表明，MK在肿瘤形成和发展中起重要作用，它主要以自分泌方式促进肿瘤细胞生长及肿瘤血管新生和内皮细胞增殖6，7，并通过上调bcl-2表达抑制肿瘤细胞凋亡8。 急性髓系白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，发病机制尚不明确。在髓系白血病细胞株中发现有MK异常表达，它可能参与了白血病的发生、发展过程4。对AML患者表达情况的临床研究目前尚未有报道。我们分别采用RT-PCR和Western blot技术检测了髓系白血病细胞株K562和HL-60中MK mRNA和蛋白水平的表达，结果与国外学者的研究报道一致4。在AML的病程中我们发现MK蛋白表达与其mRNA表达相平行；MK的表达在M2、M3、M4、M5各亚型间无显著性差异（P0.05）；MK表达与患者的治疗期有关，初治组的MK mRNA表达率和表达水平高，缓解后MK mRNA表达率和表达水平降低或测不出，复发组的MK mRNA 表达率和表达水平再次升高，提示在AML患者中MK主要来源于白血病细胞，MK表达的变化参与了AML的病情进展，对MK含量测定有助于判断病情变化。AML-CR组的MK表达虽明显低于初诊AML组，但仍高于正常对照组，这是否与CR后仍残存白血病细胞有关，有待于进一步观察研究。 MK水平高低与肿瘤预后密切相关9，10。我们发现白血病化疗疗效和预后与MK有一定关系。MK不表达或低水平表达者预后较好，MK高水平表达者缓解率低，容易复发，预后差，5例MK阳性缓解患者在我们随访期间均复发。临床耐药组MK mRNA的表达率(57.69%)和平均表达水平(0.53) 明显高于临床敏感组MK mRNA的表达率(25.64%)和平均表达水平(0.215)(P<0.01)，这从一个侧面反映AML化疗耐药现象与MK基因高表达有关。 研究发现，很多控制生长发育的基因直接参与凋亡的调控。bcl-2是重要的凋亡抑制基因，能抑制多种因素引起的凋亡。在大多数的肿瘤和白血病细胞中该基因都高表达，其表达高低与细胞的耐药性形成密切相关。已知白血病的形成和发展与bcl-2的表达密切相关，我们检测了65例AML患者bcl-2基因的表达水平，观察到bcl-2 mRNA的平均表达水平明显高于正常对照组，并用直线相关分析得出MK mRNA表达与bcl-2基因水平呈正相关，这说明MK可能是通过上调bcl-2表达、抑制白血病细胞凋亡、降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，使细胞产生多药耐药。深入研究MK在白血病中的作用将有助于我们更全面地了解白血病的发病机制。【参考文献】 1Tsutsui J，Kadomatsu K，Matsubara S，et al. 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