微生物检验的关键环节把控课件课件

微生物检验的关键环节把控,湖南省第二人民医院检验科 湖南中医药大学临床医学院检验教研室 黄露萍,2,标本采集与运送环节 细菌的分离培养 涂片、染色、镜检技术规范,一、标本采集和运送,标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的环节 由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易把控的环节 造成的后果是：阳性率低、假阳性（污染造成，对病人危害最大）,（一）痰标本的采集,采集时间：用抗生素前 采集方法： 1.咳痰： 咳痰前,患者用无菌生理盐水漱口；咳出深部痰，勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。 2.气管吸出物 :当气管插管的患者出现肺炎症状时，从气管中吸痰留取气管吸出物标本。 3.气管镜：可采集到感染部位高质量的标本，包括支气管肺泡灌洗液标本（BAL）、支气管灌洗液标本(BS)、保护毛刷标本（PSB）及支气管穿刺活检标本，均由呼吸科医生或经培训医生采集。 4.诱导痰（通常不用于细菌培养） 标本运送：在1h-2h内室温关至微生物室验室。,筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本,拒收24h内重复采集的痰细菌培养标本。 唾液。 鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子。 咽部标本。 未经保护套管收集的支气管刷培养标本。 痰的厌氧菌培养标本。除支气管穿刺吸出物、PSP、活检标本、胸水或其他末经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格。 诱导痰：此标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。,（二）泌尿标本的采集,采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集，标本管不应含防腐剂和消毒剂。 要尽量采集晨尿，使尿液在膀胱内潴留一夜或潴留至少4h以上，这样可降低假阴性率。 耻骨弓上穿刺采集尿 - 此法为“金标准”。 直接膀胱导尿，可导致继发性感染，一般不推荐此法 清洁中段尿：采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。 长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。 儿童尿液采集袋：此法培养结果阴性更有意义。 采集后的标本应立即送检，不能2h送到的尿标本，在保存和运送中均需要4冷藏，且不能超过24小时。,尿液标本拒收,超过2h而未冷藏的尿液标本。 未提供采集时间及采集方法的尿液标本。 过夜的标本。 不适于尿道感染诊断的导尿管尖的培养。 来自导尿患者尿袋中的尿液。 送检时容器有渗漏的尿液。 除耻骨弓上穿刺采集标本以外的申请做厌氧菌培养的尿液。 如果以上不合格标本临床要求必须培养时，要求在报告中注明，并强调此培养结果仅供参考。,（四）便标本的采集,1、采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。 2、采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。,（五）血液及骨髓标本的采集,1、采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外。 2、采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。 3、采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。,（五）血液及骨髓标本的采集,4、采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。 5、儿童：采血量是总血量的1%。 6、延迟培养瓶处理: 延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱，放常温，尽早送往临床细菌室。 7、皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。,关于夜班血培养的送检,培养瓶夜班未能及时送到检验科，存在室温即可，不能冷藏也不能放入35 的温箱 。过夜不会对检测造成影响，但仍需尽快送检。冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。温箱会导致细菌进入生长对数期，从而错过检测的最佳时期。,血标本采集间隔时间,对于非持续性菌血症，同时或短时间内采集23套血培养，因为体内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌。 可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养，30分钟内完成3套血培养的采集，采集后立即进行抗菌药的经验治疗。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。 可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套，连续采集3套标本。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。,脑脊液标本的采集,无菌操作，由医生腰椎穿刺采样 最少1 mL，最好5 mL 打入3个小管中，以第一根小管送检培养 即时送检，一般不能超过1小时。 绝对不能冷藏！,二、分离培养基本操作规范,合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基、培养环境以及正确的处理方法同样不能获得好的结果，为此制定如下基本操作规范以保证致病细菌分离成功。,（一）平板的划线分离方法,17,18,19,分区划线法,图 示,2019/5/17,22,连续划线法,Maki 滚动法,24,错误涂法,（二）正确的培养基放置方法,1、加盖、倒置（底朝上） 3、放置于合适的培养环境 2、不可叠加太高（不超过4个）,（三）各种标本的培养基及培养条件,1、痰标本 培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂。 培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、置5-7%CO2、35环境培养，其他培养基置35空气培养。 真菌培养：沙保弱琼脂培养基，28空气培养。,2、尿标本, 培养基：5%羊血琼脂、中国兰、伊红美蓝琼脂或CLED平板。 菌落计数：每个标本都要做，用加样器或定量 接种环取样本10ul分别接种于上述培养基均匀 涂布整个平皿，次日作菌落计数。 培养环境：35空气环境培养,3、大便标本, 培养基：中国兰、SS琼脂。 培养环境：35空气环境培养。 疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱 琼脂，5%羊血琼脂置35空气环境培 养。沙保弱琼脂置28空气环境培养。 其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。,4、分泌物标本, 培养基： 5%羊血琼脂、中国兰。 培养环境：35，空气环境培养。,5、静脉导管尖端标本,静脉导管尖端 ： 培养静脉导管尖端是为了明确细菌来源。最常用的方法是半定量的方法，方法是用5cm长的导管末端部分在血液琼脂平板上滚动4次。培养物出现15个以上的菌落，提示有潜在的导管相关性感染。,6、脑脊液标本, 培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、葡萄糖肉汤 培养环境：置5 % CO2、35环境培养。,7、胆汁或胸水或腹水标本, 培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本 量有限，可接种5%羊血琼脂、中国兰、葡萄糖肉汤。 培养环境：35空气环境培养。,8、脓液标本, 培养基：5%羊血琼脂、中国兰。 培养环境：35，空气环境培养。,9、生殖道标本,普通细菌培养标本接种： 培养基：5%羊血琼脂和5%兔血巧克力琼脂。 培养环境：置5%CO2、35环境培养。 淋球菌标本的接种： 培养基：接种于专用MTM平皿上。 培养环境：置5%CO2、35环境培养。,36,37,三、细菌涂片、染色与镜检操作规范,1、标本涂片,接种平板后用刚接种平板的拭子涂抹玻片，如为痰，重新挑取脓性或无血部位痰或气管吸出物涂抹玻片，涂片应薄且均匀（透过涂片部位可看清楚下面印刷品的字迹）。,2、固定,使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固 可改变菌体对染料的通透性 加热固定可杀死细菌，比较安全 自然干燥或恒温干燥器上干燥后，经甲醇固定或火焰快速固定3次。,3、染 色,临床实验室应具备最基本的染色技术 革兰氏染色 抗酸染色 墨汁染色,涂片,干燥,固定,染色,水洗、吸干,镜检,染色一般程序,制备涂片标本染色,革兰染色,革兰染色原理 细菌的等电点较低，约在pH 25之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。,革兰染色的步骤,45,革兰氏染色注意事项,革兰氏染色成败的关键是酒精脱色，革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。 菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡 或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。,革兰染色报告必须包括,染色反应或微生物种类和类别 描述物种的形态或结构 如革兰染色见到革兰阳性球菌，呈葡萄状排列； 又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。,用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格,10鳞状上皮细胞/LPF拒收！,弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本,纤毛拄状上皮细胞,红色革兰阴性菌、紫色革兰阳性菌,呈堆或四联排列的革兰阳性球菌提示葡萄球菌,革兰氏阳性球菌,链状的革兰阳性球菌：提示链球菌 短链，6个细胞，提示肠球菌或B群链球菌；肺炎链球菌,血培养中长链的革兰阳性球菌（6个细胞）提示化脓链球菌或草绿色链球菌,革兰氏阳性球菌,外型奇特的酵母菌，不要遗忘革兰阴性杆菌。,革兰氏阴性球菌,细胞内细菌,58,痰标本报告原则,a) 白细胞和优势菌（不粘附在鳞状上皮细胞上）有助于预测肺部致病菌，应该报告； b) 每个油镜视野可见大于10个或小于10个单一形态细菌并与白细胞相关，有助于预测肺部致病菌，应该报告；涂片中少于1个菌/20个油镜视野的少量细菌不必报告； c) 虽然由两种致病菌同时引起的感染不常见，但当两种形态的细菌均与白细胞相关时也应报告； d) 即使涂片未见细菌时仍有助于评价患者状况，可能隐藏着某些特殊菌，如军团菌、内源性真菌、结核分枝杆菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌； e) 质量合格的标本中，涂片有正常菌群及多种细菌（通常白细胞内有空泡或液泡），提示有吸入性肺炎，应该报告。,60,显微镜观察革兰染色结果,痰涂片在低倍物镜下检测20个40个视野，气管吸出物涂片分别在低倍镜视野（LPF）和油镜视野（OIF）下观察。计算有细胞视野的细胞平均数量，记录鳞状上皮细胞（SECs）和多形核白细胞（WBCs)的数量。 注1：低倍镜下细胞计数：1+（偶见）：少于1个/LPF；2+（少量）：1个9个/LPF；3+（中量）：10个25个/LPF；4+（大量）：大于25个/LPF. 注2：油镜下细菌计数：1+（偶见）：少于1个/ OIF；2+（少量）：1个5个/ OIF；3+（中量）：6个30个/OIF；4+（大量）：大于30个/OIF.,抗酸染色,抗酸染色原理:分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。,62,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥 固定,抗酸染色染色步骤,63,抗酸染色步骤,2、染色包括初染、脱色、复染三步。,冲洗 干燥 油镜观察,石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精30 1 美蓝复染1 ,冲洗,冲洗,初染,脱色,复染,64,抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。,抗酸染色注意事项, 无菌操作 涂片厚度要适中 染色时间要充分 脱色是关键步骤，要彻底 初染加热勿沸腾勿干涸。,形态： 细长，略弯曲的杆菌，常堆积成团，排列无序，偶可见呈分枝状生长，无鞭毛和芽胞。 染色性： 不易着色，抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景及非抗酸性细菌呈兰色。,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌,69,涂片结果报告标准,抗酸染色涂片结果报告,抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。 不能报告找到结核杆菌但可报告未找到结核杆菌,71,结核菌检测方法,抗酸染色 结核杆菌培养 结核菌素试验 结核杆菌血清学检查 结核杆菌的抗原、抗体检查 结核杆菌基因检测（PCR）,72,73,墨汁负染色,目的 墨汁负染色法观察新型隐球菌的形态。 原理 新型隐球菌的荚膜较厚，一般不易着色，同时菌体折光性较强，用墨汁负染色法可在黑色背景下看到透亮菌体。,墨汁染色染色步骤,取脑脊液第一管标本3000r离心15分钟，移去上清液，试管内留下0.5ml左右，混匀。 分别取2滴混匀了的脑脊液和1滴墨汁放入清洁小试管底部，混匀。 取一张清洁载玻片，把2滴脑脊液和1滴墨汁的混合物混匀放在载玻片，把盖玻片覆盖于菌液上，避免产生气泡。 放置2分钟左右后镜检。,墨汁负染色法镜检,隐球菌可于黑色背景下见一圆形或卵圆形透亮菌体，外有一层透明的宽厚荚膜，荚膜较菌体大1-3倍，折光性强。 急球菌大小不一，有的孢子生芽，芽颈甚细。微调观察有双圈。 在低倍镜下，把光线调暗，并调整微调，能清楚看到菌体有双层反射光圈。 菌体次中央或偏侧有一空泡。,新型隐球菌形态,酵母菌，芽生繁殖 在脑脊液、痰液组织中呈圆形或板圆形， 直径约520m， 四周包括肥厚的胶质样夹膜。,77,墨汁负染色法结果的观察,78,墨汁染色注意事项,注意先将盖玻片一边接