《受体细胞》PPT课件.ppt

(1)受体细胞 (2)重组DNA分子转入受体细胞 (3)重组子的筛选,目的基因导入受体细胞,第1节 受体细胞,受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell) 实验技术: 能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞 实验目的: 有应用价值和理论研究价值,一.原核生物细胞,作为受体细胞的优点: (1)不具纤维素壁 (2)无核膜 (3)基因组简单，便于遗 传分析 (4)单细胞,作为受体细胞的不足: (1)不具真核蛋白折叠系统 (2)不具真核蛋白加工系统 (3)蛋白酶降解异源蛋白,目前作为受体菌的原核生物有: (1)大肠杆菌 革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解最清楚 b.易培养、繁殖迅速,(2)枯草杆菌 革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物 分泌到培养基； b.无内毒素； c.易于保存与培养。,(3)蓝细菌 a.光能自养型，易于培养； b.与植物密码子和启动子的通用性， 易于表达植物基因,二.真菌细胞 低等真核生物，具有真核生物基因结 构、表达调控体系，具有真核的蛋白 折叠、加工与分泌系统,酵母菌 a.结构最简单的真核生物， 遗传背景较为清楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养 e.可分泌,三.植物细胞,具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁 原生质体转化(纤维素酶处理) 基因枪或农杆菌直接转化 植物细胞的突出优点: 细胞具有全能性,四.动物细胞 多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养 常用的动物细胞受体: 小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国 仓鼠卵巢细胞(CHO)等,动物细胞的优点： 可识别并除去内含子，加工成成熟mRNA b. 翻译后加工，产物具有较好的免疫原性 c. 易感染，遗传稳定 d. 可分泌表达产物 缺点： 组织培养技术要求较高，周期长，难度大,第2节 重组DNA分子转入受体细胞,转化(transformation) 重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持并表达的过程,一.重组DNA分子转入大肠杆菌 细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化 局部原生质体化假说): a.细菌感受态形成 b.转化因子的吸收 c.整合复合前体形成 d.单链DNA转化因子的整合 e.转化子的形成,供体菌,受体菌,感受态,单链整合、重组,转化子,非转化子,对于来自于人工重组DNA, 而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态,1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法,制备感受态细胞 1970年，Mandel和Higa用Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进 了大肠杆菌对噬菌体DNA的吸收 1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化,a.培养生命旺盛的菌体(对数生长期) A600约等于0.4,b.沉淀细菌 5000g离心5min,c.化合物处理(CaCl2处理) 冰浴菌液(4C)加入等体积CaCl2溶液, 15min,冰浴菌液(4C),4000g离心5min，弃去上清液,冰浴菌液(4C)中加入等体积CaCl2溶液, 放置15min,沉淀用1/15原体积CaCl2溶液重悬,4C下保存，备用(2天内),DNA分子转化感受态细胞 感受态细胞加入DNA分子 42C水浴上放置45秒(热激) 会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里,CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态 可能的原因: Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+ 复合物接近细胞膜，当42C热激处理 时，膜出现间隙，DNA分子进入,Flash2,Flash1,2. 电穿孔转化法 1988年，Dower等人转化大肠杆菌,基本原理: 高压电脉冲导至电穿孔(electro poration),制备感受态方法: 冰浴 重悬,3. 三亲本杂交转化大肠杆菌法 三亲杂交(tri-parental mating)结合转移法 基于非结合型质粒的迁移作用建立的方法 适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌,4. 转化效率计算及影响因素 转化效率两种表示方式: 转化率 = 转化子 / DNA分子个数 或 转化率 = 转化子 / DNA质量 转化率 = 转化子 / 受体菌总数,转化效率的影响因素 质粒大小、结构(超螺旋与否)、与宿主亲和 性、质粒浓度(与转化效率正比例关系) 不同受体细胞具不同转化效率 转化方法不同具不同转化效率 电穿孔法 Ca2+诱导法三亲杂交法,二.重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 转染(transfection) 与质粒DNA转化方式相似，重组噬菌体DNA 分子 直接导入到受体细胞 重组型转化率103-104 pfu (plaue forming uint) 转导(transduction) 通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径 将外源DNA分子导入受体细胞 重组型转化率106-107 pfu,噬菌体体外包装技术 (1) 外包装蛋白缺陷型 1975, Becker 和Gold首先建立 D蛋白缺失突变株 E蛋白缺失突变株,包装过程: 制备包装物 BHB2690 (D缺失突变) BHB2688 (E缺失突变) 体外包装,(2) cos位点突变型 1985, Rosenberg,三.受体细胞选择,受体细胞 利于外源DNA的转化或转导 具有较好的安全性,如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处 自身限制-修饰作用，对外源DNA具一定降解作用 存在潜在治病性,诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株: 限制-修饰系统 限制系统缺陷型菌株(hsdR -) 重组系统 重组蛋白缺陷型(recA- recB- recC-) 易于转化或转导 有明显的选择性差异 遗传表型差异大, 易于重组子筛选 感染寄生缺陷型,四.重组DNA分子转入真核细胞,1.重组DNA分子导入植物细胞 (1)农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌(Agrobacterium) 土壤习居菌 感染绝大多数双子叶植物与蕨类植物 对绝大多数单子叶植物无侵染能力,外植体 用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官 如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等,共培养 感染后的带菌外植体, 在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养,几种外植体的转化方法: 叶盘转化法 整株植物转化法 原生质体转化 悬浮细胞培养 水稻等,种胚制作悬浮细胞,(2)DNA的直接转移 多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等 电穿孔转化法 激光微束穿孔法 显微注射 超生波介导转化法 基因枪 脂质体介导法 花粉管导入法,2.重组DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡萄糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 显微注射技术 电穿孔法 脂质体介导法,第3节 重组子的筛选,重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为 转化子，含有重组DNA分子的转化子为重组子 筛选(screening) 选择(selection),一. 遗传表型直接筛选法,1.根据载体选择标记初步筛选转化子 (1)抗药性筛选 氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(Kn 或Kan) 四环素(Tc或Tet) 链霉素(Sm 或Str),(2)插入失活筛选,(3)插入表达筛选 与插入失活相反,(4)显色互补筛选法 -互补 -半乳糖苷酶基因(LacZ),载体(含LacZ ) LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息，编码-互补肽 宿主菌 编码的缺陷型-半乳糖苷酶 肽段,乳糖类似物诱导 IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷) 作用底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷),LacZ,(5)利用报告基因筛选植物转化细胞 选择标记基因(selective gene) 报告基因(reporter gene) 利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来； 表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达 融合蛋白，从报告基因的表达情况了解目的基因 的表达情况及推测基因调控序列。,新霉素磷酸转移酶(NPT II) 潮霉素磷酸转移酶(HPT) 氯霉素乙酰转移酶(CAT) 抗除草剂bar基因 -葡萄糖酸苷酶(GUS) 荧光素酶 (LUC) 冠瘿碱和成酶,(6)利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 新霉素磷酸转移酶基因(NptII) 胸苷激酶基因(tk) 二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt),2.营养缺陷型筛选 转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相 关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型 培养基上生长。 这种培养基对于非转基因克隆是致死的。,2.形成噬菌斑 噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型 形成噬菌斑即为重组子，空载不能有效包装 插入型 空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选,二. 依赖重组子结构特征分析的筛选法 1.快速裂解菌落鉴定分子大小,A,B,2.限制性核酸内切酶分析法,3.利用PCR方法筛选重组子,三. 核酸分子杂交检测法 核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适 宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配 对原则特异性地复性，形成双链。,探针(已知核酸片断，单链),待测核苷酸序列(单链),Southern印迹杂交 1975年，E.Southern 首先建立 针对于DNA的杂交技术，又称DNA印迹杂交,Southern印迹杂交的基本步骤 DNA转膜,双链DNA碱变性,单链DNA,硝酸纤维素膜或尼龙膜,转膜,电转移,虹吸作用,2.Northern印迹杂交 针对于RNA的杂交技术 步骤与Southern印迹杂交基本相似,与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解,变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等) RNase抑制环境,3. 菌落(或噬菌体)原位杂交 1975年，M.Grunstein和D.Hosness提出菌落原位杂交 1977年，W.D.Benton和R.W.Davis噬菌斑原位杂交 不必分离细菌或噬菌体DNA, 经溶菌和变性处理 后，使DNA暴露出来并于滤膜结合,印迹,碱处理； 烘烤,加入探针,3. 核酸杂交的探针 (1)常用探针类型： 同源或部分同源 19-24bp 总cDNA探针 特异cDNA探针 人工合成寡核苷酸探针,(2)探针标记物 放射性标记物 32P 高放射性 半衰期14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期87.1 d 3H 放射性弱 半衰期12.35 a 非放射性标记物 生物素(biotin) 地高辛(digoxigenin),Biotin,Avidin,BCIP/NBT,紫蓝色沉淀,Dig,抗Dig抗体,碱性磷酸酶,(3)探针标记方法 化学法 酶标记法,切口平移法(nick translation labeling),DNA酶I,DNA聚合酶I标记的dNTP,探针平均长度600bp,随机引物法(random primed DNA labeling),随机6-12bp单核苷酸引物,变性,一般探针长度在400-600bp之间,末端标记法(terminal labeling) 3末端 5末端,PCR标记法 光敏标记法 生物素、地高辛等,光敏基团与生物素结合,化学衍生结合标记法 转氨标记法等,四.DNA序列测定法,(1)化学法(Chemical sequencing) 美MaxamGilbert