科技奖励申报禽流感动物模型免疫机理及疫苗研制与推广应用ppt课件

肇庆大华农生物药品有限公司,广东省实验动物监测所,广东大华农动物保健品股份有限公司,2011年11月,禽流感动物模型、免疫机理及疫苗研制与推广应用,立项背景,总体思路,主要技术内容,主要创新点,汇 报 提 纲,五,六,三,二,一,四,七,相关知识产权与获奖励情况,主要技术经济指标与推广效益,主要完成人对项目的贡献,禽流感的危害,经济损失巨大,危害人类健康,影响国家形象 和社会稳定,2005年11月8日，温家宝在黑山防治高致病性禽流感医疗站看望医疗、防疫人员。,一 立项背景（1）,迄今为止，全世界已有超过 4亿只家禽染病死亡或惨遭扑杀，造成的经济损失高达200 亿美元,我国2004年、05年、06年大规模爆发禽流感，养禽业损失150亿美元以上,世界卫生组织（）发出警告，一场全球性的流感大流行将会导致200万700万人命丧黄泉,人们心理恐慌，不敢吃鸡，家禽业受损，出口受阻，旅游业受挫，行业经济全面受到冲击，影响社会稳定,粮农组织的资料显示，H5N1高致病性禽流感疫情于2003年爆发后，在全球己感染565人，导致331人死亡。,今年9月，联合国粮食及农业组织(FAO)官员卢布罗夫日前发出警告，一种致命的“H5N1”高致病性禽流感变种病毒在越南出现。现有的所有疫苗对该病毒均无效果。,1、我国地域辽阔，候鸟的迁簁致使禽流感长期存在，加剧防疫的难度。 2、禽流感毒株变异快，对疫苗防控技术提出新的挑战。 3、动物禽流感疫苗生产工艺落后，标准化水平低，亟待改进。 4、研究人禽流感疫苗和药物缺乏哺乳动物模型，有待摸清和建立哺乳动物的免疫机理。,针对以上问题，进行了“禽流感动物模型、免疫机理及疫苗的研究”,肌肉变绿,一 立项背景（2）,禽流感防治存在的问题,二 总体思路,1、通过蛋白重组技术，建立禽流感疫苗产业化的基础种毒和疫苗毒株，研制高致病性多变异型的高效疫苗，用于动物禽流感的防控。 2、利用造模毒株建立哺乳动物模型,为人禽流感疫苗和药物研究提供技术支持。 3、研究新的生产工艺，制定新的标准，为禽流感疫苗产业化提供检验标准和制造标准。,三 主要技术内容,三 主要技术内容（1）,1、制备禽流感毒株,筛选造模毒株,确定鹅源禽流感H5N1病毒(A/Goose/Guangdong/NH/2003)是适宜的毒株，不必经哺乳动物细胞适应，利用鸡胚内扩增病毒后即可感染哺乳类实验动物，并在体内增殖，表现出与人禽流感相似的临床病症。,筛选疫苗毒株,最终选取H5N1（Re-1/4/5）、H9（SS）和(SS/94)作为制备疫苗毒株，这些毒株毒力弱、免疫原性好，能突破母源抗体干扰，生产种毒各项性能指标领先。,三 主要技术内容（2）,2、研究建立哺乳动物模型及模型指标,（1） 利用造模毒株建立了近交系BALB/c小鼠和封闭群ICR小鼠两个小鼠模型。确定了近交系BALB/c小鼠和封闭群ICR小鼠的接种剂量100uL ，可使感染小鼠死亡率达到73%；通过不同接种途径的研究，确定鼻腔接种后感染小鼠出现明显的禽流感临床疾病过程。,同时确定了小鼠模型的临床症状、死亡率、病理变化、病毒复制、免疫反应等方面指标要符合人类感染禽流感疾病的基本特征,（2） 确定用“环甲膜穿刺术”经气管接种为猴呼吸道接种方式，建立了恒河猴模型。该方法可以将接种物直接接种到肺内，操作技术简单，定量准确，动物损伤较小，不需较高防护设备。,同时确定了恒河猴模型的临床症状、体温、呼吸频率、感染器官、抗体水平、外周血白细胞的动态变化、外周血T 淋巴细胞及其亚群的动态变化、免疫因子、病理变化方面的指标，要与人禽流感疾病相似。,三 主要技术内容（3）,3、研究禽流感免疫机理,小鼠模型免疫机理,（1）主要表现T细胞免疫功能损伤，这种损伤与感染病程的发展和转归相一致，细胞免疫功能指标下降时期也是病情严重时期。到达恢复期各指标渐恢复正常。T细胞免疫功能低下是免疫病理改变之一。 （2）细胞因子表达失去平衡或过多的表达，都可能对宿主产生免疫病理损伤，推测这是H5N1禽流感引起哺乳动物严重疾病的另一重要致病机制。,恒河猴模型免疫机理,主要表现为外周血淋巴细胞数和一些T淋巴细胞亚群在第1天出现一过性下降，T 淋巴细胞亚群CD3T淋巴细胞、CD3CD4+T淋巴细胞和CD3CD8+T 淋巴细胞也在感染的第1 天出现一过性的下降，感染后第7天出现抗体，并逐渐升高，11天后达到最高，至90天仍维持较高水平。抗H5N1抗体能有效保护并减轻病毒对机体的再次攻击，抑制病毒增殖，为人禽流感疾病的免疫接种或抗体治疗提供了直接依据。,三 主要技术内容（4）,4、研制禽流感系列疫苗,建立生产种子库,研究质量控制关键点,将基础毒种经SPF鸡胚复壮、增殖与传代，建立种子批，经病毒含量、血凝特性、毒力、安全性、免疫原性、特异性、纯粹检验等试验检验均符合要求。同时，定期对不同代次的基础种毒和生产用种毒对免疫原性相关基因HA和NA进行测序并分析其序列是否变异，以确保种毒不发生变异。,（1）确定多联疫苗的质量控制关键点为“抗原浓缩”和“乳化”技术； （2）通过比较Millipore的横向切流、中空纤维、连续离心等进行浓缩抗原的方法，最终确定了抗原浓缩（23倍）是免疫保护效果与单苗一致的关键工艺。 （3）研究不同乳化设备对乳化效果的影响，最终确定选择了进口乳化设备是最佳乳化工艺的关键。按照该工艺生产的疫苗，乳化颗粒均匀，稳定性好，疫苗中抗原释放速度合理。该种疫苗在2-8的保存期超过15个月，疫苗免疫鸡后持续期超过5个月。,在实验室研制、中试研制取得成功的基础上，向农业部申报新兽药证书和生产批准文号，本项目成功研制并获得2个新兽药证书和5个生产批文：H5+H9(N28+SS)、ND+IB+H9（La Sota+M41+SS/94)、H5N1（Re-1)、 H5N1（Re-5)、 H5N1（Re-5+ Re-4)、H9（SS),中试生产及临床应用,申报新兽药证书和生产批文,在实验室试制取得成功的基础上，在生产车间按照制定的制造及检验试行规程连续生产不少于3批，经检验合格后，申报获得临床批文，对不同品种普通鸡免疫，免疫数量不少于20000只，通过观察免疫后的临床症状和检测抗体水平，确定试制产品安全有效，同时最终确定免疫剂量、保存条件和保存期，建立质量标准。,4、研制禽流感系列疫苗,三 主要技术内容（6）,5、研究新工艺、新标准,（1）采用多级筛选、保证抗原质量： 胚蛋、孵化前期、后期、接种后和收获前均对不合格的胚蛋进行挑除； （2）筛选优化疫苗配方，解决了免疫后出现疫苗残留、肿块、肌肉变绿等不良反应； （3）对疫苗乳化颗粒大小进行了监控，疫苗乳化颗粒大小为0.2-3微米；极大地延长了疫苗保存期（2年），远高于国家标准（1年）。,提出了原材料的来源和质量要求,改进生产工艺,（1）经过研究最终确定采用SPF或非免胚蛋培养病毒，能极大地提高病毒滴度并降低了外源病毒的污染； （2）研究、筛选国内外油佐剂，最终确定采用进口佐剂，相对传统生产工艺疫苗免疫后，HI抗体水平提高1-2滴度。,四 主要创新点,四 主要创新点（1）,1、在国内首次研究哺乳动物禽流感免疫机理，率先建立禽流感感染模型及模型指标。,项目查新结论,除本项目的相关研究人员发表的论文外，未见到国内和国外有与本委托项目“禽流感H5N1病毒初次和再次感染中免疫机理的实验研究”中较早且系统测定禽流感H5Nl病毒的哺乳动物BABL/C小鼠模型的CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞免疫和IL-2、IL-4、IL-10、 IL-18、TNF-与IFN-细胞因子变化的创新点相同的文献报道，创新点相同的文献、专利和成果报道。,四 主要创新点（2）,2、发现黄酮类化合物及单抗物质有效防治禽流感。,项目查新结论,除本项目的相关研究人员发表的论文外，未见到国内有与本委托项目中直接利用鹅源禽流感H5N1病毒感染哺乳动物、在未经预先适应的情况下通过鼻腔接种ICR小鼠和BALB/c小鼠或通过“环甲膜穿刺术”经气管注射感染恒河猴的造模方法、小鼠模型及恒河猴模型、模型指标等创新点相同的文献、专利和成果报道。,植物黄酮类化合物的用途,表没食子儿茶素没食子酸酯微囊颗粒及其制备工艺,四 主要创新点（3）,3、研制了防控禽流感的系列疫苗,禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗（N28+SS株）,鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株）,四 主要创新点（4）,4、研究新工艺，制定新标准，改善行业标准。,五 主要技术经济指标与推广效益（1）,主要技术指标,小鼠和恒河猴模型感染禽流感病毒后，其病理症状应符合人类感染禽流感疾病的基本特征，成功建立了禽流感的动物模型。 建立了抗原浓缩技术、填补了动物疫苗细菌内毒素检测技术、突破了乳剂疫苗的颗粒度，解决了乳剂疫苗的不稳定性和分层，疫苗保护期延长至2年，完善了疫苗生产新标准。,附：疫苗质量新标准,主要经济指标,2008-2010年项目经济效益,（单位：万元/万美元）,五 主要技术经济指标与推广效益（2）,2003-2010年共销售禽流感疫苗156.24亿羽份，年均增长率34%；实现销售收入11.44亿元，年均增长28%。,五 主要技术经济指标与推广效益（3）,主要经济指标,2003-2010年禽流感疫苗销售量（亿羽份）,2003-2010年禽流感疫苗销售收入（万元）,08-10年H5亚型禽流感疫苗推广应用情况（万羽份）,五 主要技术经济指标与推广效益（4）,越南注册证,埃及注册证,08-10年禽流感疫苗出口产品情况（万羽份）,五 主要技术经济指标与推广效益（5）,禽流感疫苗是防控疫情的关键，为养禽业的生产安全保驾护航。控制疫情发生，降低动物对人感染的风险。 近3年销售禽流感疫苗47.33亿毫升，减少禽类捕杀损失1154亿元，节省治疗费用5亿元 H5：69.95亿羽份3斤/只5.5元/斤=1154.18亿元 H9：24.7亿羽份（0.3-0.07）元/只=5.68亿元 保证养禽业健康发展，增加农民收入，推进“三农”工作实施。,社会效益,五 主要技术经济指标与推广效益（6）,六 相关知识产权与获奖励情况（1）,获得发明专利2个：-植物黄酮类化合物的用途（授权号：ZL 200410074592.8）； -表没食子儿茶素没食子酸酯微囊颗粒及其制备工艺（授权号： ZL 200710165270.8） 获得新药证书2个：-禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗 证号： （2006）新兽药证字33号； -鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 证书号： （2011）新兽药证字15号 获得生产批文5个：-禽流感灭活疫苗（H9亚型，SS株） 证号:兽药生字（2011）190032080； -鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 证号:兽药生字（2011）190032168 -重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-1株) 证号:兽药生字（2011）190022098 -重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 证号:农医药便函200927号 -禽流感油乳剂灭活疫苗（H5亚型，N28株) 证号:兽药生字（2006）190022077,共发表论文共计33篇，其中S