课件：酶的提取与分离纯化.ppt

酶的提取与分离纯化,（制作人：王众 黄文辉 王晨）,要点,：细胞破碎 ：提取 ：沉淀分离 ：离心分离 ：过滤与膜分离 ：层析分离 ：电泳分离 ：萃取分离 ： 结晶 10：浓缩与干燥,1 细胞破碎,细胞破碎是通过各种过程使细胞外层结构破坏的技术过程。 细胞破碎的方法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法,机械破碎法,1 捣碎法 定义 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。 使用范围 动物内脏 植物叶芽 细菌 2 研磨法 利用研钵，石磨，细菌磨，球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。必要时加入石英砂等助磨剂。 使用范围 植物和微生物组织细胞的破碎 3 匀浆法 利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。 使用范围 易于分散，颗粒较小，比较柔软的组织细胞 也可以对捣碎法和研磨法产生的颗粒进行进一步研磨,物理破碎法,定义：通过温度，压力，声波等物理因素的作用是组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎 1 温度差破碎法 利用温度的突然变化热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法称为温度差破碎法 用于脆弱，易于破碎的细胞的革兰氏阴性菌，酶提取时 温度不能过高，难于用于工业生产 2 压力差破变化碎法 利用压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力破碎法。常用的有高压冲击法，突然降压法 及渗透压变化法 渗透压变化法是渗透压突然变化引起的细胞破碎的方法，此法特别适用于膜结合蛋白酶细胞间质酶等的提取，但对革兰氏阳性菌不适合，主要是细胞壁由肽聚糖组成，能承受渗透压的突然变化。 3 超声波破碎法 利用超声波发生器所发生的声波或者超声波的作用，使细胞膜产生空穴（cavitation)而使细胞破碎的方法。 简便，快捷，效果好，特别适合微生物细胞的破碎，对数生长期的细胞进行破碎,化学破碎法,定义：通过各种学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法。 常用的化学试剂：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有机溶剂 表面活性剂 ：特里顿（Triton）， 吐温（Tween) （非离子型） 原理：有机溶剂使细胞膜的磷脂结构破坏，改变细胞膜的通透性，低温下进行。 表面活性剂与磷脂及至蛋白相互作用，破坏细胞结构。 表面活性剂有离子型和非离子型两种。离子型对细胞膜的破坏性 效果较好，但会破坏酶的空间结构，故采用非离子型的。,酶促破碎法,定义：通过细胞自身的酶系或者外加酶制剂 的催化作用，使细胞的外层结构遭到破坏，而达到细胞破碎的方法。 自溶法：自身酶系， 取决于温度，离子强度。 外加酶： 革兰氏阳性菌 溶菌酶破坏, 糖苷键 酵母菌 葡聚糖酶 水解 -1，3-葡聚糖 霉菌 几丁质酶 植物细胞 纤维素酶，半纤维素 酶和果胶酶,提取,定义：在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也成为酶的提取。 酶的主要提取方法,提取方法,1盐溶液提取： 大多数蛋白酶都溶于水(P酶），而且在低浓度盐溶液条件下，酶的溶解度随着盐浓度的升高而增大的现象称为盐溶。当盐浓度达到一定的界限后，酶的溶解度随着浓度的提高而降低的现象称为盐析。 核酸类酶（R酶）的提取，一般在细胞破碎后，用0.14mol/L的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，在进一步与蛋白质等杂质分离酶 酸溶液的提取： 有些酶在酸性溶液的溶解度大，且稳定性好，宜用酸溶液提取，不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（）的硫酸溶液提取 碱溶液提取： 适用于在碱溶液溶解度大且稳定性好的酶 ，例如天冬氨酸酰胺酶在 的碱液提取。注意加碱液时要一边搅拌一边搅拌加入，以免局部过碱，造成酶失活。 有机溶剂提取 与脂质牢固结合且含有较多非极性集团的酶，可采用与水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有机溶剂提取，例如琥珀酸脱氢酶，胆碱脂酶，细胞色素氧化酶采用丁醇提取。,影响提取的主要因素,温度 温度对酶的提取效果影响明显，适当提高温度，可以增加酶的溶解度和分子扩散速度，但温度过高会引起酶的变性失活。采用有机溶剂时，温度控制在低温条件下。室温下提取的有酵母醇脱氢酶，细菌碱性磷酸酶，胃蛋白酶。 溶液的对酶的溶解度和稳定性有显著影响，不同的酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同，酶在等电点的溶解度最低，故提高溶解度应该避开等电点，但不能过高过低。 提取液的体积 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。过量的提取液会使酶浓度降低，对分离纯化不利。所以提取液总量一般为原料体积的体积，最好分几次提取。 在酶的提取过程中，体积小，颗粒的比表面积大，扩散面积大，有利于提高扩散速度，适当的搅拌和适当的延长时间，可使酶更好的溶解出来。注意为了保护酶的稳定性，可加某些保护剂，如与酶作用的底物，辅酶，某些抗氧化剂。,沉淀分离,定义：沉淀分离就是改变某些条件或者加入某些物质， 使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他物质分离的技术过程。 沉淀分离方法 沉淀分离方法 分离原理 盐析沉淀法 利用不同的蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度不同的特性，通过在酶液中 定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，使酶和杂质分离 等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点的溶解度最低的特点和不同的物质具有不同的等电点的特 点，通过调节溶液的，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶和杂质分离 有机溶剂沉淀法 利用酶在有机溶剂具有不同溶剂的特点，通过加入一定量的有机溶剂，使酶和杂 质分离,盐析沉淀法,定义:盐析沉淀法简称盐析，是利用不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解度不同的特性，通过在酶液中加入一定浓度的中性盐，使目标酶或杂质从酶液中析出，从而达到使酶与杂质分开的方法。 原理：盐离子会改变蛋白质表面的电荷，同时改变了水的活度，使分子表面的水化膜发生改变。 酶的溶解度和离子强度有确定的定量关系 (S/S0)=-Ks I 式中，s为蛋白质或酶在离子强度为I时的溶解度（g/L）；S0为酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂）的溶解度（g/L）；Ks为盐析系数；I为离子强度。 上式子中 S=S0 - Ks I=-Ks I 为s0, 主要取决于酶或蛋白质的性质，也和温度和PH有关，当温度和PH一定时，为一常数。 Ks为盐析系数，主要取决于盐的性质，Ks与离子价数成正比，与离子半径和溶液的界电常数成反比，与酶或蛋白质的结构液有关。,盐析沉淀法,离子强度I的计算 I= mi为离子浓度（mol/L）； 为离子价数,miZi2,盐析沉淀法,1 在一定的温度和PH条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定盐浓度和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和PH，使不同的酶和蛋白质分离的方法，称为分段盐析。 2 常用的中性盐有硫酸铵，硫酸钠，硫酸钾，硫酸镁，氯化钠和磷酸钠，硫酸铵最常用，因为硫酸铵在水里的溶解度大且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。但用硫酸铵，缓冲能力较差，而且铵离子的浓度会干扰蛋白质的测定，所以有时用其他中性盐盐析。 在硫酸铵盐析时，常用饱和度表示浓度 定义：溶液中加入饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比。相关数据可以查文献。,等电点沉淀法,原理：利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电点的特性，通过调节溶液的PH，使酶或蛋白质沉淀析出，从而使酶和蛋白质分离的方法。 由于在等电点时，两性电解质表面的水化膜依然存在，故实际上酶等大分子蛋白质仍有一定的溶解性，从而使沉淀不完全。在实际中，此法经常与其他方法一起使用，如等电点经常与盐析沉淀，有机溶剂沉淀，和复合沉淀一起使用。单独使用时，主要是从粗酶中除去某些等电点相差较大的蛋白质。 加酸碱时，一边搅拌一边慢慢加进，防止局部过酸过碱一起蛋白质变性。,有机溶剂沉淀法,定义：利用酶和杂质在有机溶剂的溶解度不同的特性，通过加入某种特定的一定量的有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶和蛋白质分离的方法。 原理：有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。既增大了溶质的静电引力，又破坏了溶质周围分子的水膜。 常用的有机溶剂：乙醇，丙酮，异丙醇，甲醇 影响因素：用量和PH（最好等电点附近） 优缺点：比盐析的沉淀易于离心或过滤；不含无机盐，分辨率高，但易引起酶变性失活，所以必须在低温下操作，沉淀析出后尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。,复合沉淀法,定义：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物沉淀下来，从而使酶和杂质分离的方法称为复合沉淀法。 常用的复合沉淀剂：单宁，聚乙二醇，聚丙烯酸 例： 菠萝蛋白酶与单宁复合可以制成药片，用于治疗咽喉炎 复合物有的可以直接中使用，有的用适当的方法，使酶从复合物中析出进一步纯化。,选择性变性沉淀法,定义：选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀，而不影响所需酶的方法。 方法：热处理，改变PH或加入某些金属离子 应用此法必须对与分离的酶以及酶液中的杂蛋白的种类含量及其物理和化学性质有较全面的了解。,4 离心分离,离心机的选择,1 常速离心机 常速离心机又称低速离心机，最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF ）在1*104g以下，主要用于细胞，细胞碎片和培养基残渣的分离，也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 2 高速离心机 最大转速在（12.5）*104r/min,相对离心力达到1*1041*105g,在酶的分离中主要用于沉淀，细胞碎片和细胞器等的分离。由于转速过高，引起温度过高引起酶失活，故有的安有冷冻装置，谓之高速冷冻离心机。 3超速离心机 转速能达到（2.512）*104r/min,相对离心力能达到5*105甚至更高。主要用于DNA，RNA，蛋白质等生物大分子以及细胞，病毒等的分离纯化，样品纯度系数的检测，以及沉降系数和相对分子质量的测定。超速离心机可分为制备用超速离心机，分析用超速离心机和分析制备两用超速离心机。,离心方法的选用,1 差速离心 采用不同的离心速度和时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 主要用于大小和密度相差较大的颗粒，操作简单方便，但分离效果较差，沉淀物中含有较多杂质，沉淀在离心管的底部受到挤压。 2 密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。 等密度梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围在介质密度范围之内，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上漂浮，只要时间足够长，就能移动到与它们各自密度相等的位置（等密度点），形成区带，这种方法叫做等密度离心或称平衡等密度离心。,密度梯度离心, 梯度介质的选取 1 有足够大的溶解度，形成所需的密度梯度 2 不会与样品中的组分发生反应，也不会引起组分的凝 集，变性和失活 3 常用的密度梯度介质 蔗糖 甘油 蔗糖密度梯度系统应用最多 密度梯度的制备 一般采用密度梯度混合器进行制备。 离心 适当地增加离心速度缩短离心时间，减少扩少散导致的区 带扩宽现象。,等密度梯度离心,密度梯度离心，由于受到密度介质的影响，故分离的颗粒并未达到其等密度位置。而等密度分离欲要求欲分离的颗粒处于密度梯度的等密度点。为此两种密度梯度离心所使用的密度介质和密度梯度范围应有所不同。 常用的离心介质 氯化銫 硫酸銫 溴化銫 三碘苯的衍生物 过程 1 密度介质和样品结合 2 离心 注意： 銫盐对铝合金转子具有极强的腐蚀作用，防止銫盐溶液溅到转子上，用完后将转子仔细清洗和干燥。最好用钛合金的。,离心条件的确定,离心力,低速离心一般用转速，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min.而在高速特别是超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如5000g.相对离心力是颗粒所受到的离心力与地心的引力的比值。 式中，RCF为相对离心力（g); FC为离心力；F g为地心引力;n为转子 每分钟的转数（r/min) ;r为旋转半径（cm). 一般离心力的数值是平均数值，即在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。,离心时间,对于低速和高速离心机和差速离心来说，离心时间是指颗粒从离心管样品液的液面完全沉降到离心官底的时间，称为沉降时间或澄清时间。 对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界限分明的区带时间，称为区带形成时间。 等密度梯度离心，是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间，称为平衡时间。其中最常用的是沉降时间。,沉降时间,沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。 t表示沉降时间（s) ;s表示颗粒的沉降系数; w表示转子的角速度（r ad /s); r1,，r2分别表示旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm) 上式子做如下变换 k称为转子因子,温度和PH,离心温度一般控制在4左右，对于某些耐热性较好的酶，也可以在室温下进行离心分离。但在超速离心和高速离心时，由于转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻装置，使温度维持在一定范围内。 离心介质的PH必须处于酶稳定的PH范围内，必要时可采用缓冲溶液，过高过低可能引起酶的变性失活，还可能引起转子和离心机其他部件的腐蚀，应当加以注意。,5 过滤和膜分离,过滤是借助过滤介质将不同大小，不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质不同分为膜过滤和非膜过滤两大类。 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可分为粗滤，微滤，超滤和反渗透,过滤的分类及其特性,类别 截留颗粒的大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 2m 酵母，霉菌，动植物 滤纸 滤布 纤维多孔陶瓷 细胞 固形物 烧结金属 微滤 0.22m 细菌 灰尘等 微滤膜 微孔陶瓷等 超滤 200.2m 病毒 生物大分子等 超滤膜 反渗透 20 生物小分子，盐，离子 反渗透膜,非膜过滤,定义：采用高分子膜以外的材料，如滤纸，滤布，多孔陶瓷，纤维，烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤，包括粗滤和部分微滤 粗滤：借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2m的颗粒，使固形物和液体分离的技术。 粗滤应用范围： 酵母 霉菌 动植物细胞 培养基残渣 大 颗粒固形物 粗滤介质 ： 滤纸 滤布 纤维 多孔陶瓷 烧结金属 助滤剂 ： 硅藻土 活性炭 纸粕 推动力 ： 常压过滤 加压过滤 减压过滤,粗滤,常压过滤 以液位差为推动力的过滤方法 过滤设备简单，操作易行方便，但过滤速度慢分离效果差 加压过滤 以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力的过滤方法。 设备简单，过滤较快，过滤效果好 减压过滤 又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空，增加过滤介质上下方之间的压力差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。,微滤,定义：又称微孔过滤。微滤所截留的颗粒直径在0.22m。无菌水，汽水等饮料的生产中广泛应用。 一般采用微孔陶瓷，烧结金属等作为过滤介质，也可用微滤膜。,膜分离技术,借助一定的孔径的高分子薄膜，将不同大小不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。 常用膜 丙烯腈 醋酸纤维素 赛璐玢 尼龙 动物膜 硝酸纤维素膜 实例：核糖体结合来确定遗传密码（硝酸纤维素的应用） 膜分离技术包括（薄膜的原理和推动力） 1加压膜分离 2电场膜分离 3扩散膜分离,加压膜分离,加压膜分离 定义：以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离 技术。 分类(以截留颗粒大小） 1微滤 2超滤 3反渗透,膜分离技术,1微滤 定义:以微滤膜作为过滤介质的膜分离 技术。 截留颗粒在0.22m,操作压力在0.1Mpa以下。例如：无菌水除菌，酶液除微生物细胞 2超滤 定义：借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的方法。 截留颗粒直径在202000，用于分离病毒和各种大分子。 操作压力：0.10.7Mpa 压力对超滤流率影响效果较复杂，视具体情况而定。 注意：超滤浓度不要太高。 超滤不仅用于酶的分离纯化，还用于酶液的浓缩，特别适用于液体酶制剂的生产。 3反渗透 反渗透的孔径小于20，操作压力在0.713Mpa，分离各种离子和小分子物质，在无离子水和海水淡化有广泛的应用。,电场膜分离,定义：电场膜分离是在半透膜两侧分别装上正负极，在电场的作用下，带电的小分子或者离子向与它们所带电荷相反的方向移动，透过半透膜达到分离的目的。 电渗析和扩散 膜分离 电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐，海水淡化，纯水制备 以及其他带电荷小分子的分离。用于凝胶电泳后含有的蛋白质或核酸的凝胶带电荷大分子的分离。 离子交换膜点渗析 与电渗析一样，只是用离子交换膜代替半透膜。,扩散膜分离,定义：利用小分子的扩散作用，不断使小分子透过半透膜扩散到膜外，而大分子被截留，从而达到分离的效果。 材料 动物膜 羊皮纸 火棉胶 赛璐玢,6 层析分离,层析分离 定义：利用混合液中各组分的物化性质（分子大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力，分配系数等）的不同，使各组分以不同的比例分布在两相中。其中一个相是固定相，另一个相是流动相。当流动相流经固定相时，不同的组分在流动相中以不同的速度流动，从而达到不同组分的分离纯化。,层析分离方法,吸附层析,定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的层析方法。,原理： 吸附剂和被吸附剂之间是范德华力。特点是可逆的，一定条件下，被吸附物被吸 附到吸附剂表面，另外条件下，被吸附物可离开吸附剂表面，称为解吸。 吸附剂： 固体吸附剂（常用）和液体吸附剂 装置： 柱形装置 洗脱方法: 1：溶剂洗脱法 2：置换洗脱法 3：前缘洗脱法,洗脱方法的曲线及优缺点,1溶剂洗脱法 从图可看出，两组分有一段“空白”， 即只有不含组分的纯溶剂，各组分能很好的分离。当两组分的吸附力相差不大时，产生“拖尾”现象，采用梯度洗脱法。,物质浓度,洗脱液体积,置换洗脱法,定义：用吸附力比被吸附组分更强的洗脱物质来洗脱 样品组分。 从图可看到，置换洗脱可使每个组分分离，每一个阶梯只有一个组分，并可以求出各组分的浓度。然而各组分一个接一个，界限不分明，交界处互相混杂，分离效果并不理想。,物质浓度,洗脱液体积,A,B,前缘洗脱法,定义：是连续向吸附层析柱内加入欲分离的混合溶液，即所使用的洗脱液为含有各组分的混合溶液本身。 从图可看出只有吸附力最弱的A组分，得以和其他组分分离，故作前缘洗脱法。,物质浓度,洗脱液体积,A,A+B,A+B+C,吸附剂和洗脱剂的选择,吸附剂的选择 吸附剂有无机吸附剂和有机吸附剂 由化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积大 常用吸附剂通常用于酶分离纯化的有：硅藻土，氧化铝（活化处理），磷酸钙，活性炭等,洗脱剂的选择 注意事项 1洗脱剂不会与吸附剂发生化学反应，也不会使吸附剂溶解。 2洗脱剂对混合液中各组分的溶解度大，黏度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离 3有一定的纯度，以免杂质对分离的不利影响 常用洗脱剂：石油醚，四氯化碳等,分配层析,定义：利用各组分在两相的分配系数不同从而达到各组分分离的层析方法。 分配系数：一种溶质在互不相容的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中浓度的比值。 溶质在流动相的带动下流经固定相时的分配系数,分配层析的方法,纸上层析和薄层分析,纸上层析 定义：以滤纸纤维结合水为固定相，以与水互不相溶或者部分混溶的有机溶剂为流动相。展开时，样品各组分在两相之间不断地进行分配，由于各组分的分配系数不同，所以移动速率不同，从而达到分离。,薄层层析 定义:将固定相支持物均匀地铺在支持板（一般用玻璃板）上，形成薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，利用各组分的移动距离不同，而使个组分分离。,离子交换层析,定义：离子交换层析是利用离子交换剂上得可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。 离子交换剂： 离子交换剂是含有若干可解离基团的高分子物质。 活性基团的性质不同： 阳离子交换剂和阴离子交换剂,离子交换剂的选择和处理,母体：苯乙烯树脂，酚醛树脂，纤维素，葡聚糖，琼 脂糖等 引入基团： 酸性基团：磺酸基（-SO3H),磷酸基（-PO3H2） 碱性基团：季胺（-N（CH3）3），叔胺（- N（CH3）2） 以阳离子交换剂为例： 分配系数： 平衡常数K是离子交换剂上活性基团与组分离子之间亲和力大小的指标。平衡常数K的值越大，离子交换剂的活性基团对某组分离子的亲和力越大 K值的大小决定组分离子在离子交换柱内的保留时间。,离子交换剂的选择与处理,选择考虑的因素 1组分离子和离子交换剂的物理化学性质 2组分离子所带电荷的种类 3溶液中组分离子的高低 4组分离子的质量大小 5组分离子和离子交换剂的亲和力大小,处理 1水浸泡 2无离子水进行洗涤澄清 3用酸浸泡，无离子洗涤至中性 4用碱浸泡，无离子水洗涤至中性 5转型处理,离子交换层析的操作过程,1装柱 干法装柱和湿法装柱子 2上柱 将欲分离的混合液加入到离子交换柱中 3洗脱和收集 4再生,凝胶层析,原理：组分在多孔凝胶进行垂直向下的移动和无定向的分子扩散运动（布朗运动）。大分子只能进入凝胶颗粒的间隙，小分子同时能进入凝胶微孔，故大分子移动的比小分子快 ，从而达到分离的目的。 凝胶层析又称凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等，以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相所含各种组分的相对分子量不同而达到物质分离的一种层析技术。,分配系数,表示洗脱体积，表示某一组分从加入层析柱到出现最高峰所需要的洗脱体积。 是外体积，即为层析柱内凝胶颗粒间隙的体积。 为内体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 1 如果组分的分配系数ka为0，即 ,说明组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱时最先流出。 2如果组分的分配系数ka=1,即是 ，说明该组分可自由扩散进入凝胶颗粒的所有微孔中，洗脱时最后流出。 3如果组分的分配系数在01，说明该组分分子大小介于小分子和大分子之间，可以进入凝胶微孔，但扩散速度较慢，洗脱时按照ka值由小到大的顺序先后排出。,凝胶的选择与处理,凝胶材料 1葡聚糖凝胶：广泛用于各种物质的分离 2琼脂凝胶和琼脂糖凝胶：适用于分子质量较大的蛋白质和多糖的分离纯化 3聚丙烯酰胺：惰性凝胶，适合酶,蛋白质，核酸的分离纯化，但不能遇强酸 交联剂：环氧氯丙烷等,凝胶层析操作过程,亲和层析,定义：利用生物分子与配基之间所具有的可逆亲和力，使生物分子分离纯化的层析方法 优缺点 优点：选择性很高，通过一次纯化分离步骤得 到很高的产品 缺点：价格昂贵，处理量不大，一般在纯化的 后期使用 影响因素 温度 PH,亲和层析母体和配基础,配基 在亲和层析中，作为固定相的一方是配基，配基必须 偶联于不溶性母体上。 母体一般采用琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺 凝胶。 配基和偶联必须对母体进行活化、。溴化氰法，叠氮法。 酶的亲和层析一般用琼脂糖作为母体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。,亲和层析方法,分子对亲和层析,定义：利用生物分子对之间专一而又可逆的性质使生物分子分离纯化的方法。 酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体等，故分子对亲和层析在酶的分离纯化中有重要的应用。 在亲和层析中控制好温度，PH等,免疫亲和层析,定义:利用抗原与抗体之间专一而又可逆的亲和力使抗体或者抗原分离纯化的一种亲和层析方法。 免疫亲和层析广泛应用于药物的分离纯化，例如工业制取组织纤溶酶原激活剂。,共价亲和层析,定义:生物分子的功能性基团与层析剂上的配基形成可逆性的共价键的一种分离纯化方法。 共价亲和层析可用于纯化牛乳巯基氧化酶，从大肠杆菌分离纯化青霉素酰化酶等。,疏水层析,定义：生物分子上的功能性基团与层析剂配基配基形成可逆性疏水键结合的一种亲和层系方法。 酶蛋白中常含有疏水性较强的氨基酸:如亮氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸。采用氨基烷和溴化氰活化的琼脂糖进行反应，形成改性琼脂糖。酶可以和改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应，从而得以分离。,金属离子亲和层析,定义:利用生物分子的功能性基团和层析剂上得金属离子形成可逆性结合的一种分离方法。 蛋白酶类和其他蛋白质表面的一些氨基酸残基如组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团，可与金属离子亲和结合。用螯合剂将金属离子（cu+2,zn+2,co+2等）螯合到母体（如交联化的琼脂糖，葡聚糖)的表面制成离子亲合剂。 洗脱方法：改变盐的浓度或PH，降低金属离子和蛋白质之间的亲和常数。 或用竞争性试剂如咪唑，组氨酸，色氨酸，半胱氨酸将蛋白质置换下来。 洗脱时，可采用分级洗脱和梯度洗脱方式。 优点:可用不同的金属螯合到母体上，可用更强的螯合剂将金属离子洗脱，实现母体的再生。大多数情况下，洗脱下的酶仍然保持生物活性。,染料亲和层析,定义:利用生物分子的功能性基团和层析剂上染料配基形成的可逆性结合的一种层析方法。 已经成功用于以NAD+,NADPH+,ATP为辅酶的多种酶的分离纯化。,凝集素亲和层析,定义：生物分子的功能性基团和层析剂上得凝集素形成可逆性结合的层析方法。 用于各种糖蛋白的分离纯化。,层析聚焦,定义:将酶的两性等电点和离子的交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的层析技术。 1离子交换剂和缓冲液体系 （1）多缓冲离子交换剂 （2）多缓冲溶液 2PH梯度的形成 3层析聚焦的操作过程,层析聚焦的操作过程,（1）多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液的选择 （2）形成PH梯度 （3）上柱聚焦 （4）洗脱 （5）再生,电泳分离,定义：带电粒子向着与自身电荷相反的电极移动的现象叫电泳。 在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定，酶分子质量的测定，酶的等电点的测定以及少量酶的分离纯化。,电泳的分类和影响因素,电泳按支持物体不同分为： 1纸电泳 2薄层电泳 3薄膜电泳 4凝胶电泳 5自由电泳 6等电聚焦电泳,影响因素 1电场强度 2溶液的PH 3溶液的离子强度 4电渗 5缓冲液的黏度和温度,纸电泳,纸电泳是以纸为支持物的电泳技术。 操作过程： 1：支持物的选择，一般采用层析滤纸为支持物。 2：选择一定的PH和一定强度的缓冲液 3：点样,量要适当 4：电泳,薄层电泳,薄层电泳:是将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行的电泳技术。 支持体：淀粉 纤维素 硅胶 琼脂 淀粉最为常用，淀粉板薄层电泳广泛应用于蛋白质，核酸和酶的分离。,薄膜电泳,薄膜电泳：醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体的电泳技术。 薄膜电泳的分辨力虽然比不上纸电泳和薄层电泳，但此法具有简单，快速，区带清晰，灵敏度高，易于定量和便于保存的特点，广泛应用于各种酶的分离。,凝胶电泳,凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。 独特之处：具有电泳和分子筛的双重作用。 支持体：聚丙烯酰胺凝胶和琼脂凝胶 应用：主要用于酶分子质量的测定，酶蛋白和酶RNA的顺序测定以及酶的分离检测,等电点聚焦凝胶,