动物细胞培养技术实验报告

(完整(完整word版)2023动物细胞培育技术试验报告一、试验目的1、学习并把握动物细胞培育的无菌操作技术。2、学习并把握细胞传代培育的方法。3、学习并把握用倒置荧光显微镜观看细胞细胞形态。二、试验原理细胞培育〔cellculture〕：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。动物细胞培育〔animalcellculture〕就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞〔使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶〕然后，放在适宜的培育基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的力气，为细胞体外培育和争论供给可能。动物细胞培育可分为原代培育和传代培育。原代培育〔primaryculture〕即直接从动物机体分别、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开头首次培育长出单层细胞的方法。传代培育〔subculture〕当细胞生长增值到达确定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到的培育皿中扩大培育的方法。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要争论单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是格外困难的，但假设把或细胞拿到体外培育、增殖并进展观看和争论，则便利简洁的多。被培育的动物细胞是格外好的试验对象和试验争论材料，对体外培育的活细胞进展争论可以帮助人类探究防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和转变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培育技术是争论细胞分子机制格外重要的试验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等争论领域。三、细胞培育相关设施及材料1、细胞培育室无菌操作区：只限于细胞培育及其它无菌操作，与外界隔离。。制备区：培育液及有关培育用液体的制备，液体制备后应当在净化工作台进展过滤除菌。贮存区：包括冰箱、枯燥箱、液氮罐等。清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。2、细胞培育常用根本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风枯燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。细胞培育常用器皿：培育瓶、培育板、培育皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。3、细胞培育用品的清洗、消毒玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其外表碱性物质：刷洗：硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；15-2031-3全部需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工作台后翻开包装。消毒灭菌：高压蒸汽灭菌〔120℃，20min〕；紫外线消毒：主要用于试验室房间空气及操作台。四、细胞培育用液及培育基1、培育用液：水〔高度纯洁〕；缓冲液：平衡盐溶液，维持渗透压，调整PH值，供给细胞生存所需能量和无机离子成分；消化液：胰蛋白酶液，EDTA，胶原酶等。2、培育基：维持体外细胞培育生存和生长的溶液。自然培育基：血清〔胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等〕、血浆和组织提取液〔如鸡胚和牛胚浸液〕水解乳蛋白；TC199BME、MEM五、动物细胞培育的条件无菌、无毒的环境：对培育液和全部培育用具进展无菌处理，通常还要在培育液中加入确定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培育液，以便去除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。养分物质：无机物〔无机盐、微量元素等，有机物〔糖、氨基酸、促生长因等〕清和血浆，但血清和血浆不是养分物质。〔3〕PH：36.5±0.5℃，7.2-7.4。所需要的特别条件：血清：动物细胞离体培育常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清供给生长必需因激素、根底培育基中没有或量很少的养分物以及主要的低分子养分物等；供给结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调整转变它们所结合的物质活力；有些状况下其结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用；生牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料、玻璃等培育基质上所需因子的来源；构成缓冲系统，调整酸碱平衡；供给蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损害；支持物气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培育过程中不断进展调整，不断维持所需CO2混合气体5%CO2PH定。六、试验内容1、用倒置荧光显微镜观看细胞形态2、动物细胞传代80%-90%时要传代；预备好所需材料，先将手及超净工作台用酒精消毒，点燃酒精灯，将滴管用火焰烧，PBS、培育基、胰酶预备好，要避开滴管穿插污染；将培育基喷酒精消毒，拿入超净工作台，用滴管把原有培育基吸掉；PBS〔PBS，不要用劲吹，细胞贴壁不好，然后吸出S；参与适当的胰蛋白酶〔使成单细胞悬液30s，可快速在荧光显微镜下观看细胞形态，吸出胰酶；参与含有血清的培育基终止胰酶消化，用滴管吹打细胞，让细胞悬浮起来；依据细胞种类把细胞传到几个培育皿中，一般癌细胞分5个，正常细胞传3个，放入孵箱连续培育；把超净工作台消毒整理干净，将用过的滴管拿出超净工作台。七、试验数据及分析倒置荧光显微镜下HaCaT细胞形态倒置荧光显微镜下A375细胞形态代用胰酶消化时，先用胰酶润洗，吸出后，孵育5min。A375胰酶消化时，在倒置荧光显微镜下可观看到细胞变圆变亮，不再贴壁，成为单细胞。八、试验留意事项1、试验进展前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照耀30-60分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开头试验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培育基一样亦不共享培育基，以避开失误混淆或细胞间污染。试验完毕后，将试验物品带出工作台，以70%乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进展下一个细胞株的操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽阔，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。试验操作应在抬面之中心无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。带入无菌操作台内。试验操作应在抬面之中心无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、留神取用无菌之试验物品，避开造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，不要在翻开的容器正上方操作试验。容器翻开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4、试验人员应留意自身之安全，须穿戴试验衣及手套后才进展试验。操作过程中留神毒性