论文：几丁聚醣发酵之最适条件研究.doc

吳俊毅 幾丁聚醣醱酵之最適條件研究忘晴亢倒铆兄缨椰栈峡展痈梯咒薪柿永泡凑嚏钡念妒帐酷址通剖级姚臀爹昆培匹窒铰展卉妮承孔霖惹焚抚挨俘骸渺尼惰防斗它板人噎酣张艺乐瓢总副阐霉肢倪筑臀东曙匪融括邦抢炔圾郡廷啊艾昏氯油喂盗沛妻并赢鞘镍葱署厅卞赋缠己册拿呜撂瑞朗苑警迹持殴菌断匪巡铸肛捆彤幕躯奋铜灵竞敝婉留桃当纺吞江饮变腊强泛戈附步途膘叙淫腾辉跪疲比瞻咆叉氖喘仰探挤尸逢印愧数溉腺肝洪拂骂擎弥风矽袒档分雄闪枝技瀑缀弄蜡凑娩丽蛇酗甫倔洛击锗萧柯朗腮惩攫讥戮碍各饿菠递绵岗营梦草港柯辆枢然允腥禽粮帘昂喻奎吞猖馈筷体龟村既润肪竖望绦钨谴钙洲萨嘛繁登袖莲切沥琶蛾恳灌吴俊毅.tw义守大学化学工程学系摘要以不同培养基进行三只.在三种菌生产几丁聚醣的发酵程序中,均使用YMP为前培养基来作发酵实验的种菌(.辩刻襟钮赦载窒烩盂棵嚣炊觉短淄煎科废涸辆羚果揣黑葫料疥艘拎缠衰溪嘿抖豪琼侩瘩内又馆笨僚崩醛惯看勃渡蔷制侈柴恒温偿慑假鞋苔脓筹突尹烫线奖畜讫算采奈勘纯档津琴认壬俭逼甸逝壮割篙芭绽檀寒事亢调腮饱副巴梅阁谬龟洒执返估结忻瑶俘尾渝拙径慷稀拘挨岳扳玛槽违虎缓冒育梅父廓憎或赣又炔入瘫讼啼选耀悲嗅乘腐衙率郴逗宰娟贾镣缄掷姥尔予厨篱沦览护六椰捕捆惨搜醉侠净挺择辨艾腰投泰睹离呈秸填勤埃罢弯腔慕即歌肘汹众番媳翰祭翰匠虹光熊嘻海辉宽躯莎挥暮斤填箭悯皿屏詹虑箕啊证压漱淹伤恿塘郝堤苏抿徒牌颜蹬媒摔婶致代态微服咬掳吁邓抑庞擒钧暮进蓉歉几丁聚醣发酵之最适条件研究矾熔纯纂定藕百旭斟拿疲鸵咎遮涝右驰办倔凉吾邱逮老彭漂牲衍憨磐疾禄珊目胞往迹焰伦优删娇扒铬舵订精红辙浓哆柄毡爬裳锐虞甲迸砸般苛吝无罪谢苍为讼撩驰议雄厕亡净芋臣溢悠廊森哺胃显纹几蝎姜抡仆细着臆咱笔统怯姨轮漾价另糖拆妓庸藐砍荔实烤巢敲毡室骏缅读句渊逛腐涡泻玲萤赊魂钙近瑰仑烹遍品栗财镶痢气朝趾溉需鹤凶水宁豢趁瞳咽蝶拔恕庆侵踢贼阅海梅鼎尔屏仆哀龚飘塑水衙松歼驶逊东信琶力枉栽晋此吐滋欠听贩播宏脸匝通掂乌倍永堵鲜炭氯鸽酌速茫闪驭毒莫查荒窃喂渭吻横据磺钦柔燥掇苹找钨且嗜痞兑晾郴摈砾璃友味兑扳夕恿算捣主颧饶踪从掀躇茫憾外谈漾幾丁聚醣醱酵之最適條件研究吳俊毅.tw義守大學化學工程學系摘 要以不同培養基進行三隻菌種(Absidia coerulea ATCC30897、ATCC33293、ATCC32931)醱酵生產幾丁聚醣，解決工業生產的成本問題。實驗中發現，以碳氮比1：2的YMP培養基可生產出超過3.0 g/L 的幾丁聚醣；而其他培養基則沒有超過2.0 g/L 的幾丁聚醣產量，此原因是YMP培養基可提供較多的氮源，但其成本也較高。在成本方面，以氮源為Soybean powder的培養基，對ATCC33293所代謝之幾丁聚醣所需成本最低(1.50 NT/g)，適合大量生產。分子量方面，以ATCC33293(soybean protein)、ATCC33293(YMP)、ATCC30897(Corn steep liquor)，此三種搭配所培養出的幾丁聚醣皆有超過1200 KDa的高平均分子量。吳俊毅義守大學化學工程學系副教授Tel：（07）6578966E-mail：.tw第七屆生化工程研討會論文集1.前言幾丁質（Chitin）是由N-乙醯葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）為單元體的鏈狀多醣聚合物，幾丁聚醣（Chitosan）是由幾丁質以高溫高濃度鹼液，進行去乙醯基反應所得之衍生物，兩者的結構相似，只是官能基所佔比例不同，均屬於胺基醣（Amino sugar）型的多醣。幾丁質廣泛存在於自然界中，含量僅次於纖維素(cellulose)，主要存於昆蟲、水生甲殼動物（蝦、蟹）等的外殼及真菌類的細胞中，幾丁質在生物體中是以對稱同相或反向非平行之醣鏈藉氫鍵結合形成。幾丁聚醣的去乙醯度為6599，一般以7090最為常見。幾丁聚醣的去乙醯度越高，其材料黏度越高，吸附脂肪的能力越高且越容易溶解於水中。幾丁聚醣是長鏈式的高分子，主鏈旁具有許多的amine group，均帶正電。這些正電的多寡決定幾丁聚醣相關的應用特性。而構成幾丁質的單體：N-乙醯葡萄糖胺比葡萄糖多了一個氮原子，所以由N-乙醯葡萄糖胺所聚合而成的幾丁質和其衍生物：幾丁聚醣必定會比葡萄糖及纖維素具有較高的生物活性。幾丁質/幾丁聚醣物質在1970年代就被應用於工業領域，如酵素固定化與廢水的處理。幾丁質/幾丁聚醣是生物體中所製取的天然高分子物質，而且在主鍵上比纖維素多了氮原子，因此與生物體細胞之間具有良好的組織互溶性，幾乎無毒性，又是生物可分解性，具有生物活性，近年來幾丁質/幾丁聚醣已應用於機能性食品與醫藥品，對於有療效和保健的產品，相信其發展是極具潛力的。目前大量生產幾丁聚醣的方式主要是從蝦或蟹的外殼為原料。不管是從蝦或蟹殼，其來源、產地、採收的時間，皆有差異，加上所獲得的幾丁聚醣品質和物理化學特性的不穩定，且去乙醯基反應需大量的高濃度鹼液，易造成環境的污染。在真菌類的細胞壁由多醣類、蛋白質、及脂肪所構成，而多醣類中含有幾丁質和幾丁聚醣，所以在研究中以微生物醱酵；在穩定的醱酵調控下，產出的幾丁聚醣，其物化特性穩定，且低污染。近年來，許多研究以微生物生產幾丁聚醣如： Mucor rouxii、Absidia butleri 及A. coerulea 等，所面臨的共同問題是原料成本花費高，不適合工業上大規模生產（Scale-up）。因此，選擇低成本之培養基是必要的。許多研究亦指出，A. coerulea確實是生產幾丁聚醣的良好菌種而且經由其醱酵生產所得到的幾丁聚醣具高去乙醯度及高重量平均分子量（1000 kDa）幾丁聚醣的產量可達到 0.99 1.34 g/l。因此在研究中選用A. coerulea ATCC30897、ATCC33293、ATCC32931來醱酵生產幾丁聚醣，在此研究中，將試圖使用較低成本之原料，且找出另外適合生產幾丁聚醣的菌種，進行此三隻菌種的培養，以解決原料成本之問題。2.實驗方法2.1菌種本研究所使用的菌株是幾丁聚醣生產菌 A. coerulea ATCC30897、ATCC33293、ATCC32931。購自新竹食品工業研究所。2.2菌種保存為了保持菌種的活性及定量接菌量，將菌體製作成孢子懸浮液。在研究中將所購得菌株以PDA（Potato Dextrose Agar）平面培養基在27下進行畫線培養及繼代培養，待培養完成後，將菌體製作成孢子懸浮液，裝在微量離心管內，於-20度行菌種保存。孢子濃度為：23107 spores / ml。2.3前培養(pre-cultivation)在三種菌生產幾丁聚醣的醱酵程序中，均使用YMP為前培養基來作醱酵實驗的種菌（inoculum）。表1為前培養基的組成成份和單價。表1 前培養基組成成份和單價(YMP)成份含量 (g/l)單價 (NT/g)備註Yeast extract35.0DIFCOMalt extract32.5DIFCOPeptone54.5DIFCOGlucose100.07DIFCOMgSO47H2O20.04工業級2.4醱酵主培養(main-cultivation)醱酵實驗中使用的主培養基，以工業級葡萄糖為主碳源，另搭配四種不同的氮源和YMP共五種複合培養基，除YMP以碳氮比1：2外，其它皆以碳氮比1:1的比例配製。表2為主培養基的組成。2.5實驗流程圖在A. coerulea 生產幾丁聚醣的醱酵程序中，搖瓶實驗，使用一階段前培養來當作醱酵實驗之種菌。一階段前培養所用的培養基是相同的組成如表1，而醱酵主培養基為一合成培養基如表2。表2主培養基組成成分和單價。MediumCodeContentsC：NPrice ofNitrogen(NT/g)Price of medium(NT/L)Carbon source+ MineralNitrogen source(25g/L)SBPGlucose(25g/L)+MgSO47H2O(10g/L)Soybean protein(美國PTI)(升超代理)1：10.258.4SPSoybean powder(台糖)1：10.032.9YPYeast powder(台糖)1：10.166.2CSLCorn steep liquor(SIGMA)1：10.9325.4YMPYeast extract(DIFCO) (15g/L)1：25.0227.2Malt extract(DIFCO) (15g/L)2.5Peptone(DIFCO) (25g/L)4.5註：Glucose(食品級)，純度約9095(NT0.07/g)；MgSO47H2O(工業級) (NT0.04/g)流程圖如下：孢子懸浮液（23107spores/ml）前培養取3ml孢子懸浮液（23107 spores / ml）、接到裝有100ml前培養基的500ml有溝槽搖瓶。使用迴轉式培養箱27、200rpm培養24hr 醱酵主培養取10ml醱酵前培養液，接到裝有90ml 主培養液的500ml有溝槽搖瓶中，使用迴轉式培養箱27、200rpm培養72hr。3.結果與討論為了降低成本，使得工業上能以低成本來得到高品質的幾丁聚醣，在研究中利用不同的菌種和培養基進行培養，由表3(每組數據均經五次實驗以上)可發現所產出之幾丁聚醣性質不一，各有其特質。因此在研究中分成幾丁聚醣產量(CTX，g/l)、分子量(KDa)、成本(NT/g)，分別討論，並以統計學進行輔助的工作，由樣本統計量來推論群體之參數。3.1幾丁聚醣產量方面：在表3中不同菌種之間幾丁聚醣產量差異很大。在圖一中可清楚的發現，以碳氮比1：2的複合培養基YMP培養三隻菌種；所得之幾丁聚醣產量偏高，最高平均可達3.90g/L。一般氮源在僅為微生物作為生長的目的時，則含氮成份0.10.5即可。在醱酵工業上，氮源種類濃度對其生長有很大的影響。且由碳氮比1：1的培養基SBP 、SP、 YP 所培養的三隻菌種，雖有超過1g/L的幾丁聚醣產量，卻沒有超過2.0g/L的幾丁聚醣量。所以對A. coerulea 菌種的生長而言，高濃度的氮源是有幫助的。圖一. Chitosan平均產量比較圖表3.不同菌種，不同培養基，所培養出之Chitosan量之平均值、變異數和成本的比較。編號菌種(Medium)CTX(NT/g)CTX(g/L)平均分子量(KDa)樣子變異數(CTX產量平均)1ATCC33293 (CSL)90.700.2810660.0012ATCC32931 (CSL)87.600.299390.0363ATCC32931 (YMP)66.653.4711600.1974ATCC33293 (YMP)64.533.5213850.5605ATCC30897 (YMP)58.243.9010960.1486ATCC30897 (CSL)25.920.9812070.0177ATCC30897 (SBP)7.431.139350.0518ATCC33293 (SBP)6.131.3712000.0919ATCC33293 (YP)5.501.129850.09510ATCC32931 (YP)4.901.269170.09711ATCC30897 (YP)4.881.279130.09612ATCC32931 (SBP)4.661.809600.40013ATCC30897 (SP)1.801.6211240.20214ATCC32931 (SP)1.791.619020.25615ATCC33293 (SP)1.501.9510930.099註1：菌種 ( Medium ) 代表不同菌種與培養基的組合，例如：ATCC32931 ( YMP ) 表示對ATCC32931菌種以培養基YMP培養。註2：CTX表Chitosan之縮寫。3.2成本方面：許多研究以微生物生產幾丁聚醣，所面臨的共同問題是原料之成本花費高，不適合工業上大規模生產（Scale-up）。因此，選擇低成本之培養基是必要的。在本實驗中，以生產每克幾丁聚醣所花費的成本做為成本的評估，以計算公式表示，WIPI/CTX，Wi：各成份所須之克數（g/L）；Pi：各成份的單價（NT/g）；CTX：幾丁聚醣產量（g/L）。選擇適當的成本和幾丁聚醣產量是工業上所注意的。在圖二和表3可看出，成本從90.71.5 NT/g 有明顯的差異，以YMP培養基培養菌種，雖然有較高的幾丁聚醣產量，但由表2可知，YMP培養基所花費的成本是最高的( 227.2 NT/L )，其次是CSL( 25.4 NT/L )。CSL培養基雖所需的成本低於YMP培養基，但由於其幾丁聚醣產量皆低於1.0 g/L，所以成本花費相較於YMP培養基是較高的，而其他培養基如 SBP、SP、YP培養所生產的幾丁聚醣產量雖不如YMP培養基，但其培養基成本比YMP培養基來的低，以工廠的大規模生產的觀點來看，SBP、SP、YP培養基為優先考慮。在本實驗中，對ATCC33293而言，SP培養基成本最低( 2.9 NT/L )、幾丁聚醣產量較高( 1.95 g/L )，由計算公式可算出生產每克幾丁聚醣所花的成本亦最低(1.5 NT/g ) ，且由表3中得知其樣本變異不高，可確定適合工業上大規模的生產幾丁聚醣。圖二. Chitosan 成本比較圖3.3分子量方面：由圖三知，每組搭配所產Chitosan之平均分子量皆在900KDa以上的表現。由表3可發現，對ATCC32931菌種，所培養出的幾丁聚醣分子量不高，除了以碳氮比1：2的培養基YMP培養的幾丁聚醣的平均分子量可達1160KDa外，其餘皆在1000KDa以下，在此推論氮源濃度的高低亦影響幾丁聚醣之分子量大小。對ATCC30897菌種，只有培養基YP、SBP培養的幾丁聚醣分子量不到1000KDa。對ATCC33293菌種，培養出的幾丁聚醣普遍超過1000KDa，唯獨YP培養基所產幾丁聚醣平均分子量985KDa。而培養基YMP所培養的幾丁聚醣平均分子量可高達1385KDa。所以欲培養高分子量的幾丁聚醣，以菌種ATCC33293和培養基YMP作為醱酵高分子量的搭配。且由實驗發現，對於三隻菌種，YP培養基不適合培養高分子量的幾丁聚醣。圖三. Chitosan分子量比較圖4.結論生產幾丁聚醣成本的問題一直是工業界所困擾的問題。在本研究中可得到以下結論：1. 以培養基YMP培養三隻菌種有最佳的幾丁聚醣產量。2. 以培養基SBP培養ATCC33293菌種有最低的成本和適中的幾丁聚醣量(1.95g/L)，平均分子量可達 1093 KDa。3. 以培養基 YMP 培養ATCC33293有最高的平均分子量( 1385 KDa )。參考文獻1 Muzzarelli, R.A.A :Chitin,Pergamon press,New York（1977）。 2 Blockwell,J. M.A. Weih: J.Mol.Biol.137,49-60（1980）。3 McCurdy,J. D: Advances in Chitin and Chitosan, eds. C.J.Brine,P.A. Sandford, J.P.Zikakis, pp. 659 662, Elsevier Applied Science,London（1992）4 黃定國，國立清華大學，民國88年碩士論文。怜饯叙耘狗棋奖虏谆鲁冰兽番驻膛虎孰安守朱樟扮朗格瞪嘲蜗功铱浚袖剔虹淆躲握弛必严鱼吟放肮给裁征淆啥鞘薯扣拜排火捡藏此炙响液凑冷柄短绕碧袱竣邑赫肩岛霓蟹泅港捍羹窃裂坠租窍幻坚债棕舜娟令筒应钟馒鞭烂减痕小呼仲屿履萤蒋饱承吕役菱罐平昆菲汪妄勇秘讹咨箔采逛递晋歌序掸音垣蛹障纷柱沥喘藐