《限制性酶切与连接》PPT课件.ppt

成都医学院-生化与分子生物实验 实验十实验十 限制性酶切与连接限制性酶切与连接 成都医学院-生化与分子生物实验 一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制 的DNA 分子称为Vectors 主要载体：质粒、噬菌体、病毒 功能：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、 表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不 同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体 载体（Vectors） 如何构建所需要的载体？ 酶切 连接等技术 成都医学院-生化与分子生物实验 成都医学院-生化与分子生物实验 一、DNA的限制性酶切实验原理 n核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来 侵袭。 n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的片段端为，端为。 成都医学院-生化与分子生物实验 n根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为、型三大类。 n第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。 n第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。 1. 限制性内切酶的类型 成都医学院-生化与分子生物实验 n第二类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内 切酶. n 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的片段； n型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； n型内切酶切割双链产生种不同的切口端突 出、端突出和平末端。 n限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。 1. 限制性内切酶的类型 成都医学院-生化与分子生物实验 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 成都医学院-生化与分子生物实验 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 平头末端： 成都医学院-生化与分子生物实验 限制性内 切酶 酶分子识别位点切割位点 限制作用 是否需用 ATP 类 三亚基双 功能酶 二分非对 称 至少在识 别位点外 1000bp Yes 类内切酶与 甲基化酶 分子不在 一起 4-6bp, 大 多数为回 文对称结 构 在识别位 点中或靠 近识别位 点无特异 性 No 类二亚基双 功能酶 5-7 bp 非 对称 在识别位 点下游 24- 26bp Yes 成都医学院-生化与分子生物实验 v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。 v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。 2. 限制性核酸内切酶的命名法 成都医学院-生化与分子生物实验 由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列 。 成都医学院-生化与分子生物实验 内切酶： n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； n 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对 u酶短时间为宜。 n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含 甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力； n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。 注意事项注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切 成都医学院-生化与分子生物实验 n作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 n这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。 五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切 ： 成都医学院-生化与分子生物实验 n反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶辅基； nTrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； nNaCl浓度不同形成种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） n 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。 五、注意事项五、注意事项限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切 反应缓冲液： 成都医学院-生化与分子生物实验 连接反应连接反应-连接酶（连接酶（ligase） ligase 又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或 把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应 相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP) 的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子 成都医学院-生化与分子生物实验 T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5-磷酸和 3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能 催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核 酸的连接。 把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1, 1:3 或 3:1 的载体:插入片段摩尔比 连接反应连接反应-T4-T4连接酶连接酶 反应体系： 载体 DNA 100ng 插入片段DNA 17ng 连接酶 10X 缓冲液 1l T4 DNA 连接酶 (Weiss 单位) 0.11u 无核酸酶水加至 10ul 2. 孵育反应于：室温下3 小时，或4C 过夜，或15C，418 小时。 成都医学院-生化与分子生物实验 实验步骤与试剂（酶切）实验步骤与试剂（酶切） 1.质粒pUC18 DNA 2. PCR产物 3. Hind内切酶 4. Hind 10 X buffer 5. ddH2O 实验步骤与试剂实验步骤与试剂 反应体系 1.质粒pUC18 DNA 2 l 2. PCR产物 2 l 3. Hind内切酶 2 l 4. Hind 10 X buffer 2 l 5. ddH2O 12 l 总体系为20 l，混匀 反应步骤 1.37C 酶切2h（各位老师上课只要求1h，自 己改一下） 2. 65C 灭活10min 3. 琼脂糖电泳检测 1.内切酶失活 2.DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子 3.条件不适（试剂、温度） 4.DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 5.DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I） 6.DNA位点上存在其它修饰 7.DNA不存在该酶识别顺序 1.标准底物检测酶活性 2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 3.检查反应系统是否最佳 4.换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株 5.换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 6.将DNA底物与DAN混匀进行切 割验证 7.换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证 限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切常见问题分析常见问题分析 q问题一：DNA完全没有被内切酶切割 原 因 对 策 1.内切酶活性下降 2.内切酶稀释不正确 3.DNA不纯，反应条件不佳 4.内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.内切酶溶液粘度大，取样不准 7.酶切后DNA粘末端退火 8.由于反应溶液、温度、强烈振 荡使内切酶变性 9.过度稀释使酶活性降低 10.反应条件不适 11.识别位点两侧插入了可影响酶 切效率的核酸顺序 1.用5-10倍量过量消化 2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3.同上 4.同上 5.反应前离心数秒 6.将内切酶稀释，增大取样体积 7.电泳前将样品置65保温5-10分 钟，取出后置冰浴骤冷 8.使用标准反应缓冲液及温度，避 免强烈振荡 9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶 不能贮藏 10.使用最佳反应体系 11.加大酶量5-10倍 q问题二：DNA切割不完全 原 因 对 策 限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 1.内切酶星状活性 2.其它内切酶污染 3.底物中含其它DNA杂质 1.检查反应条件：甘油浓度大于12% ，盐度过低，Mn2+的存在及酶： DNA值过大均均可导致星状活性 ，降低酶的用量 2.用DNA作底物检查酶切结果 3.电泳检查DNA，换用其它酶切， 纯化DNA片段 q问题三：DNA片段数目多于理论值 原 因 对 策 限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 1.DNA定量错误（如RNA 含量较高） 2.在酶切反应液中形成非 特异的沉淀 1.用RNA酶A（无DNA酶） 100ug/ml消化DNA样，酚抽提 后沉淀溶解，定量 2.在反应前透析DNA样品或用酒精 沉淀二次 q问题四：酶切后没有观察到DNA片段的存在 原 因 对 策 限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 1.保存温度不合适 2.以稀释形式保存 3.贮藏缓冲液不适当 4.低蛋白浓度 1.内切酶贮藏在含50%甘油的 贮藏液中，应在-20低温保 存 2.稀释酶液不宜长期存放，应一 次使用 3.使用厂家推荐的贮藏缓冲液 4.内切酶与500ug/ml的BSA一起 保存 q问题五：内切酶保存期内快速失活 原 因 对 策 限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 1.DNA上结合有蛋白质 2.内切酶中含有DNA外 切酶 1.减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶 2.减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶 q问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一 原 因 对 策 DNA电泳常见问题分析 1.含磷酸盐的浓度高 2.内切酶失活不全或含有 ATP酶 3.平末端连接 4.外切酶污染 5.连接缓冲液不合适 1.透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 2.延长灭活时间或用酚抽提，乙 醇沉淀回收DNA 3.加大T4 DNA Ligase用量 4.减少酶用量，缩短保温时间， 酚抽提回收DNA 5.重新配制连接缓冲液 DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 q问题七：酶切后的DNA片段连接效率低 原 因 对 策 1.DNA降解 2.电泳缓冲液陈旧 3.所用电泳条件不合适 4.DNA上样量过多 5.DNA样含盐过高 6.有蛋白污染 7.DNA变性 1.避免核酸酶污染 2.电泳缓冲液多次使用后，离子强度 降低，pH值上升，缓冲能力减弱 ，从而影响电泳效果。建议经常更 换电泳缓冲液 3.电泳时电压不应超过20V/cm，温 度30；巨大DNA链电泳，温 度应15；核查所用电泳缓冲液 是否有足够的缓冲能力 4.减少凝胶中DNA上样量 5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 6.电泳前酚抽提去除蛋白 7.电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀释DNA DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 q问题一：DNA带模糊 原 因 对 策 1.对于/Hind III片段cos位 点复性 2.电泳条件不合适 3.DNA变性 1.电泳前于65加热DNA 5分钟，然 后在冰上冷却5分钟 2.电泳电压不超过20V/cm；温度 30；经常更换电泳缓冲液 3.以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电 泳前勿加热 q问题二：不规则DNA带迁移 对 策 原 因 DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 1.DNA的上样量不够 2.DNA降解 3.DNA走出凝胶 4.对于EB染色的DNA，所 用光源不合适 1.增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝 胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高， 上样量可适当降低 2.避免DNA的核酸酶