HPLC方法建立和优化.ppt

HPLC方法的建立和优化 绪论 目录录 分离的基础 2 色谱柱 3 样品分离的系统方法 4 梯度洗脱 5 1 定性和定量分析 目录录 6 方法的完善 7 绪 论 色谱仪器介绍 色谱仪器： 控制器 输液泵 储液瓶 溶剂组织器 进样器 色谱柱（柱温箱 ） 检测器 色谱仪器介绍 原理图： 输液泵 进样器 色谱柱 检测器 色谱工作站 储液瓶 HPLC方法建立的步骤 HPLC方法建立的步骤 HPLC方法建立的步骤 样品的性质，确定分离目的 v 了解样品的相关情况： o所含化合物的数目； o化学结构（官能团）； o分子量； opKa值； oUV光谱图； o被测组分在样品中的浓度范围； o样品的溶解度、沸点及其稳定性； o可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。 o要分离的化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化 合物 1.1 样品具有什么样的性质？ v 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱 鉴定？ v 是否分析所有组分？定性？一种条件有困难？分组分析？ v 定量分析的准确度和精密度？（主成分精密度在12 ） v 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留 、环境样品等） v 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。 v 实验室的条件，如HPLC仪器的配置和档次；色谱柱系统； 是否有恒温？是否可以做梯度？分析成本？实验室人员的操 作技能如何？方法是否具有可移植？等等。 1.2 明确分析目的 v 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配） v 需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作 v 固体样品选择合适的溶剂溶解后进样 v 需提取分离的样品 v 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。 总之，将样品溶于合适的溶剂；或者用合适的溶液提取 出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意 被测组分的稳定性和提取率 1.3 样品的预处理与检测 v 按照样品的特性分为以下二类： nA 一般样品（分子量 1.5 样品保留值0.52000(理论踏板数） 溶剂消耗越少越好 目标： 1.6 HPLC方法优化 v 合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法 的稳定性。 v 对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切 实可行的办法。 v 建立合理的数据处理方法等。 1.6 方法的优化 1.7 完善HPLC方法 v 定性与定量方法的建立及论证。 v 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样 品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的 稳定的分析方法。 v 解决出现的问题 v 方法的可移植性 1.7 完善HPLC方法 1.7 完善HPLC方法 问题 1、柱效低 2、色谱柱寿命短 3、保留值变化 4、定量精度差 5、出现干扰峰 6、峰严重拖尾或前趋 7、分离度不够，峰不能完全分开 经常出现的问题： 二、色谱柱基础知识（ 一） 2.1 色谱柱的性能指标 1、 柱效率:N 实际工作中一般取1/2峰高处计算柱效（保留时间） ： N=5.54（tR/t1/2） 2 基本理论踏板数计算公式： N VR/W 2 W Method Wtan 16切线法 W1/2h 5.54半峰高 W3 93 w4 164 w5 255 VR tR vR 50% 32.4% 13.4% 4.4% W W3 W1/2h W5 W4 tR 2.1 色谱柱的性能指标 1、 柱效率:N W5 W4 W5 W4 从图上可以看出，如 果峰拖尾，采用N1/2h 和N4的方法测柱效 时，拖尾的影响反应 不出来，而如果采用 N5时，2号图的柱效 就可以反应出来 W1/2h W1/2h 1 2 2.1 色谱柱的性能指标 2、死体积V0/保留体积VR/相对保留体积VR 死时间t0/保留时间tR / 相对保留时间tR : VR vR tR VR tRt0 v0 V0 :包括色谱柱死体积 、管路以及接口的死体 积。死体积的大小体现 了色谱柱和仪器系统的 好坏。 2.1 色谱柱的性能指标 2、保留因子k: VR vR tR VR tRt0 v0 k :用来描述色谱柱中溶 质的迁移速度 kVR/V0 2.1 色谱柱的性能指标 3、分离因子（ a ）: VR vR tR VR tRt0 v0 a :用来描述和表征两 种不同的溶质在色谱柱 里的分离过程 a k2/k1 2.1 色谱柱的性能指标 4、峰的对称性（ AS）: AS :用来描述和表征两 种不同的溶质在色谱柱 里的分离过程 As：0.951.3（一般） 1.5 好不好很差 干净样品： 溶液均质，其成分在每次进样之间都能完全流出色谱柱 2.2 色谱柱常见问题 1、保留值与分离度重复性不好 结果原 因主 要 变 化 柱间差异基体、键合的不同k 、a 使用期间柱变化柱床扰乱N 键合相丢失k 、a 硅胶基体溶解k 、a 非流出物质堆积堵塞k 、a 柱外效应进样量大N 死体积N 分离控制不好流动相组分改变k 、a 流速改变N 、a 温度改变k 、a、N 柱平衡慢再平衡时间不足k 、a 柱超载样品质量过大k 、N 2.2 色谱柱常见问题 2.2 色谱柱常见问题 2、峰不对称：导致分离的质量和精密度下降 金属杂质如铁和铝等 ，会导致硅胶表面活性增 加，使碱性化合物和螯合 物的色谱峰严重拖尾。 2.2 色谱柱常见问题 2、峰拖尾解决方法 2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱寿命 2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱寿命 低pH流动相中寿命缩 短的主要原因是键合相在 酸性条件下水解，这会导 致保留时间和峰形的明显 改变 2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱的维护 三、色谱分离基础 3.1 溶剂的基础知识 Acetone THF MeOH MeCN EtOH MeOH 溶剂粘度： 3.1 溶剂的基础知识 溶剂强度： 水乙醇 甲醇 正己烷 异丙醇 二氯甲烷 四氰呋喃乙酸乙脂 非极性极性 乙腈 3.2 液相色谱的分离度 分离度Rs： 色谱的根本目的是将混合物分离成单一的化合物！ v 评价一个HPLC方法的标准之一：分离度。 v 下面两个图哪个分离更好些？ 3.3 液相色谱的分离度 3.4 不同的分离度 v 分离度的方程 n k 是保留因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。 K=(tR-t0)/t0 ; n a 是分离因子（选择性），描述两化合物分离的好坏程 度。是化学因素。受流动相和固定相影响。 a = k2 /k1; n N 是理论塔板数（柱效），描述色谱峰的谱带展宽程度 。受柱长短和颗粒度大小以及流速影响。 3.5 影响分离的因素K、a、N 初始 改变k 增加a 增加N K、a、N 对分离度的影响 v 改变k值的方法 n调节流动相的溶剂强度 npH、离子强度、温度等（温度每升高1度，k减少12） n梯度淋洗 改变K、a、N 的途径 HPLC方法手段结果 反相有机溶剂比例增加K变小 改为溶剂强度更强的溶剂K变小 增加温度K变小 正相极性有机溶剂增加K变小 离子对与反相相反 离子交换离子强度增加K变小 v 改变a的途径 n 改变流动相 n 改变温度 n 改变样品的本身性质 n 改变固定相 改变K、a、N 的途径 条件（流动相）结果 改变B%（所有）a改变 改变有机溶剂（所有）a改变 混合有机溶剂（所有）a改变 改变PH（离子）a改变 改变离子对试剂浓度（离子）a改变 改变缓冲液或缓冲液浓度（离子）a改变 改变添加剂浓度（离子）a改变 加络合试剂（可络合时）a改变 v 改变a的途径 n 改变流动相 改变K、a、N 的途径 v 改变N值的方法 n减小填料的颗粒度 n找到最佳的流速（根据不同内径） n合适的温度：粘度低、温度高 n降低溶剂的粘度 n增加柱长 n减小柱外效应 改变K、a、N 的途径 v 改变N值的方法 n减小填料的颗粒度 n找到最佳的流速（根据不同内径） n合适的温度 n降低溶剂的粘度 n增加柱长 改变K、a、N 的途径 范德米特(van Deemeter)曲线 v 体积超载： v 质量超载（高浓度） 进样量的影响 四、液相色谱的分离机理 4.1 液相色谱的分离机理 4.1.1 吸附色谱 4.1.2 分配色谱 4.1.3 离子色谱 4.1.4 体积排阻色谱 4.1.5 亲和色谱 色谱柱（二） 色谱柱 4.1 色谱柱填料 3.2色谱柱与塔板数的关系 v 色谱柱的塔板数越高，柱效越高，分离效果越好。 v 理论塔板数的计算： v v 3.3好色谱柱应具备的性能 v 好的峰形 尤其对对于碱性化合物, 可以不加额额外的流动动相添加剂剂 减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性 v 高的柱效 1.8um,3.5um和5um，不同的粒径可以满满足任何分离的柱效要求 柱效N 采用柱效进进一步优优化分离度 v 好的选择选择性 C18是最受欢欢迎的键键合相，且适用于大部分化合物的分离 v 在较宽较宽的流动动相范围围内均可使用 简简化方法开发发； 适于更多的应应用 v 出色的重现现性 不同批次的色谱谱柱都有很好的重现现性 v 好的使用寿命 至少能分析1000 个样样品 3.4保证柱寿命和性能良好 1.针对不同的样品选择合适的填充柱 2.减小压力波动，避免猛烈撞击 3.溶剂和样品严格过滤，使用保护柱和在线过滤片。 4.间断性地用强溶剂冲洗柱子：正相用氯仿/异丙醇1：1； 反相用甲醇 5.复杂样品进行前处理，尽量减少无谓的强滞留成份和微粒 6.不要超过柱子使用的PH值范围，一般2-7，防止键合相流失 7.不用的柱子要冲洗掉里面的缓冲液，用乙睛保存，避免高浓 度的水和醇类。 3.5色谱柱问题及解决办法 v 保留值值与分离的重现现性 v 1.选择选择色谱谱柱时时，应应考虑虑其化学性质质 v 2.在流动动相中用缓缓冲剂剂，以除去化学的或硅羟羟基效应应， 尽量减少谱谱峰拖尾。 v 3.保证证温度，流速，压压力和溶剂剂成分的恒定。 v 4.流动动相上机要脱气 v 5.保证证上样样不超载载 v 谱谱峰拖尾 v 柱外效应应 4.样品分离的系统方法 v充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 n普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 v观察流动相条件改变时色谱峰的移动 n根据变化的方向及大小决定下一步干什么 v改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ v色谱柱的改变影响最大 4.1 分离前的准备 v 想办法得到各种信息 n向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析 方法 n查文献，如CA(化学文摘) n仪器制造商的文献，如Waters v 对色谱柱有足够的了解 n掌握分离机理，自己开发方法 v 充分了解您自己的样品 4.2 首先要了解的内容 v 分析前要知道： 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? v 分离的目的和要求： 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?灵敏度的要求有多高? 4.3 一般的具体步骤 v 先用一根短的色谱柱 v 用相对较高的流速 v 使用尽可能纯度高的标准品 v 先用高强度的洗脱液 v 调节k 值改变保留值 v 调节a值改变选择性 v 调节柱长度改变柱效及分离速度 4.4 尽量采用文献方法 v 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? v 注意文献方法的流动相 n是否损害色谱柱? n如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 v 注意色谱柱的规格：内径、柱长 n需要调整流速、进样量 v 注意梯度条件 v 了解系统的滞后体积（梯度） 4.5 反相色谱的方法开发 v 开发过程实例 n色谱条件 n色谱柱：C18，4mm30mm n流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、 40/60，由强渐弱 n流速：2ml/min n样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 反相色谱条件的改变 v 改变容量因子 K v 改变色谱柱 v 改变选择性a：通过改变流动相改变选择性 4.6离子型化合物的分离方式 v使用离子交换柱离子交换法 n主要用于“强”阴、阳离子 v使用反相柱 n离子抑制色谱法 n通过改变流动相的pH值，使样品成中性 n离子对色谱法 n加入“对离子”，使样品呈中性 4.7 离子抑制色谱 v离子型化合物在反相色谱柱上不保留 v改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 v适用于弱酸性化合物的分离 n降低流动相的pH值，使样品降低离子化 n使用硅胶基质C18填料 v使用条件应在填料基质的范围内 n硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内 4.8 离子对色谱法 v在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 n与样品中可电离的组份形成“对离子” n在反相色谱柱上分离离子型化合物 v离子对试剂的类型 nPIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸 nPIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱 n烷基长度不同，形成对离子的能力不同 n通常有：B5，B6，B7，B8 nPIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱 4.9 其它影响因素 v 流速对柱效的影响 n不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 v 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 v 样品的进样体积对柱效的影响 v 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度 v v 5.梯度洗脱 v 定义义：使流动动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂剂， 在洗脱过过程连续连续或间间断改变变流动动相的组组成，以调节调节 它的极性，使每种流出的组组分都有合适的容量因子 k 并使样样品中的所有组组分可在最短的分析时间时间内， 以适用的分离获获得圆满圆满的选择选择性分离。 v 适用于：当样样品中的第一个组组分的k 值和最后一个组分的 k 值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱效果 特别别好。 5.1 梯度洗脱的特点 v优点 n单位时间的分离能力增加 n检测灵敏度提高 v缺点 n仪器设备要求高 n不适合某些检测方式 n柱需再生 n定量分析的重复性较低 5.2 梯度的洗脱方式 v高压梯度及低压梯度 5.3 梯度洗脱的可变参数 v A及B液的成分和化学特性 v 梯度的陡度 v 梯度的变化形状 5.4梯度曲线的变化凹线 v 梯度曲线的变化凸线 v 5.5 梯度条件的优化 v 5.6 梯度平衡时间的影响 v 5.7 有机污染物的影响 v 超纯水的有机物污染最少。尽量使用其做梯度洗脱 v 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度 分析 v “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析 5.8 梯度方法开发实例 - 第一步 v 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱， 在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个 色谱峰组保留时间太长，分离度也不好 梯度方法开发实例 - 第二步 v 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水 -乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰 ，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的 梯度方法开发实例 - 第三步 v 梯度方法开发实例 - 第四步 v 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂（共两 个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量 分析结果不准确 梯度方法开发实例 - 第五步 v 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用 #5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰 仍没有分出来 梯度方法开发实例 - 第六步 v 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用 #5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象 梯度方法开发实例 - 第七步 v 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。 6. 定性和定量分析 v定性和定量方法的建立及论证 v 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、 偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳 定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定 的分析方法 6.1 色谱峰定性 v鉴别每个色谱峰 n通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱 峰所对应的组份 n大多数情况下用比较保留时间来定性 v即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份 6.2 色谱峰的确认 v用“标样”的保留值定出被测组份的位置 v进一步的确认 标准加入 同时用其他方法 n其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） n其他检测器 nPDA，光谱图比较、谱库检索 nMS，质谱图解析、谱库检索 n其他仪器方法 6.3 定量分析的具体内容 v 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 v 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 v 色谱峰的定性，峰一致性测定 v 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 v 用标样建立标准曲线 v 检查方法的准确度及精确度 v 用标样定期检查方法 6.4 痕量分析 v 如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要： n分析前浓缩样品 n选择高灵敏度检测器 n用衍生法 v 使色谱体系最优化 n使用短的微径柱（减少样品的稀释） n使用高效色谱柱 n使k值尽可能小 n增加进样体积和浓度 n使用低流速（N增加） n采用梯度淋洗 6.5 液相色谱定量精度的计算 v测量精度的计算 6.6 常用的定量方法 v 峰面积百分比法 n由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 v 外标法 n在液相色谱中用的最多 v 内标法 n准确，但是麻烦 n在标准方法中用的最多 6.7 峰面积百分比法定量 v公式： v特点： n各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应 值一样简单，液相色谱目前很难做到这点 n与进样量无关 n不需标样 n简单 v 6.8 外标法定量 v 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量（二） v 实际色谱图 外标法定量（三） v 计算公式 v v 特点 n无需各组份都被检出、洗脱 n需要标样 n标样及样品测定的条件要一致 n进样体积要准确 6.9 内标法定量（一） v 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 内标法定量（二） v 实际色谱图 标准曲线 内标法定量（三） v 计算公式： v 特点： n无需各组份都被检出、洗脱 n需要标样，需要内标样 n结果与进样体积无关 内标法定量（四） v对内标物的要求 n化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) n在样品中不存在 n不与样品中组份发生任何化学反应 n保留值与待测组分接近 n浓度（响应值）与待测组分相当 n其色谱峰与其他色谱峰分离好 6.10 定量校正曲线 v 曲线A： n因在零浓度时仍有色谱峰， 可能有