实验一蛋白质的定量测定.ppt

实验一 蛋白质的定量测定 Folin-酚试剂法(Lowry法) 蛋白质及氨基酸的呈色反应 n（一）双缩脲反应 n是由两分子尿素缩合成一种化合物的反 应。 2尿素双缩脲+氨 180度 双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复 杂的紫红色络合物，这一呈色反应称为双缩脲 反应。 n蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相 似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形 成紫红色或蓝紫色络合物。通常可用此 法来定性鉴定蛋白质的存在，也可根据 反应生成颜色的深浅，在540nm波长处 进行比色，定量测定蛋白质的浓度。允 许测定范围为0.2-1.7mg蛋白质/ml。 n（二）蛋白质的黄色反应 n芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的 蛋白质所特有的呈色反应。 n蛋白质遇硝酸后，产生白色沉淀，加热 后沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈 橙黄色。 n（三）酚试剂反应 n蛋白质分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸 中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷 钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝 的混合物）。 n（四）乙醛酸反应 n在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管 壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会 出现紫色环，凡含有吲哚基结构的化合 物都有这一反应。 n（五）坂口反应 n精氨酸分子中所含量胍基能与次溴酸钠 （或次氯酸钠）及-萘酚在碱性溶液中 形成红色产物。 n（六）米伦反应（illon） n米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、 亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米 伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀 变为红色。酚类化合物有此反应。 常用的蛋白质定量测定的方法 n凯氏定氮法 n双缩脲法 nFolin-酚法 n紫外（UV）分光光度法 n考马斯亮兰染色法 一、实验目的 1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质 含量的原理。 2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质 含量的方法和操作。 二、实验原理 n Folin酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由 碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质 中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用 ，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫 酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪 氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量 成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。 n进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波 长：若蛋白质含量高时（25-100g）在500nm波长 处进行测定，含量低时(5-25g)在755nm波长处进行 测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋 白质的含量。 n此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备， 灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法 灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可 以稳定几个小时。 n缺点是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空 白试验消除。此法是在Folin酚法的基础上引入双缩脲试剂，因 此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2 以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖， 硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin酚反应。此外，所测的蛋白 质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓 度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（ 1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）， 乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测 样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵 ，则需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较 高，也需提高碳酸钠氢氧化钠浓度12倍，这样即可纠正显色 后色浅的弊病。 n三、实验材料 n（一）实验器材 n100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4 支，5毫升2支；722型分光光度计。 n（二）实验试剂 n试剂甲： n1) 4%碳酸钠溶液 n2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 n3) 1%硫酸铜溶液 n4) 2%酒石酸钾钠溶液。 n临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠氢 氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸 铜酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1 的比例配合，即成Folin酚试剂甲。此试剂临 用前配制，一天内有效。 n试剂乙： n称钨酸钠（Na2WO22H2O）100g，钼酸钠（ Na2MoO42H2O）25g置2000ml磨口回流装置内， 加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。 充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加 小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（ LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中 开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至 1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为 鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保 存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液 溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。 n试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢 氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶 液颜色由红紫红紫灰墨绿时即为滴定终点。该试 剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于 1mol/L酸度应用。 n（二）标准和待测蛋白质溶液 n1. 标准蛋白质溶液 n结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量 凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度 配制成150ug/ml蛋白溶液 n2. 待测蛋白质溶液 n人血清，使用前稀释100倍。 四、实验操作 1. 绘制标准曲线:取7支试管，按下表分别加入各试剂 试 剂 管 号 0123456 标准蛋白质溶液(ml) 00.10.20.30.40.50.6 蒸馏水(ml) 1.00.90.80.70.60.50.4 Fo1in-酚试剂 甲(ml) 5555555 摇匀，室温下放置10分钟 Fo1in-酚试剂 乙(ml) 0.50.50.50.50.50.50.5 迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水为空白 ，在500nm处比色 A500 n各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇匀 ，放置30分钟后比色，在500nm处记下 各管光密度，以0号管为对照，以光密度 为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐 标，绘制标准曲线。 n2. 测定未知样品： 取2支试管，分别准确吸取1毫升样 品溶液，各加5毫升Fo1in-酚试剂甲， 摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫 升Fo1in-酚试剂乙，立即摇匀，放置30 分钟，在500nm处测定光密度值。 2.未知样样品蛋白质浓质浓 度测测定 取4支试试管，分2组组，按下表平行操作： 试管编号 试剂处 理 空白管 2 样品管 2 血清稀释液/ml00.2 蒸馏水/ml1.00.8 Folin酚甲试剂 /ml 5.05.0 摇匀，于2025放置10min Folin酚乙试剂 /ml 0.50.5 迅速摇匀，30（或室温2025）水浴保温30min，以蒸馏水 为空白，在640nm处比色 A500 五、注意事项 (1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin 酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性 的