药品蛋白的稳定性：升级.doc

药品蛋白的稳定性：升级版摘要：1989年，Manning, Patel, 和 Borchardt写了一篇关于蛋白稳定性的文章，这个文章大量的参考了以前的工作。当时,重组蛋白治疗还处于初级阶段。这篇综述总结了关于蛋白稳定性和剂型的进步。另外讨论了当前已知的蛋白质化学和物理的不稳定性，部分章节还包括蛋白在水溶液和干粉状态下化学和物理的不稳定性。使用化学改造和诱变提高稳定性及化学和物理的相互作用的不稳定性。介绍：1989年，Manning, Patel 和 Borchardt写了一篇综述总结了那时已知的蛋白药品的稳定性和稳定，这篇文章被引用了500次，二十世纪八十年代晚期，在美国市场仅有三种重组蛋白产品：Orthoclone (OKT-3), 人胰岛素和 tissue plasminogen activator.。如果一个包含血浆来源的产品，获准的生产的蛋白仅有十二个。显然的，重组DNA技术已经极大地改变了药品市场。现在仅仅在美国市场以有近20种抗体产品和几乎150种以蛋白为基础的产品被普遍应用。另外的，我们所知的关于蛋白稳定性和剂型已经急剧的增加。本篇综述的目的是阐述过去20年中我们所了解的蛋白稳定性的进步。除了更新原有的评论文章的部分，在1989年的文献中没有被讨论的主题在这篇文章中被讨论，例如发生在生物过程中的蛋白质化学和物理的不稳定性的相互关系，生物加工过程中冻干周期对蛋白质的稳定性影响，以及在维持蛋白质稳定性的过程中包装的重要性。我们把蛋白不稳定分为两种：化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性涉及共价键的合成和断裂的过程，生成新的化学实体。表一中列出一个较为常见的化学降解过程。相反，蛋白质的物理不稳定性其化学成分并没有改变，而是蛋白质物理状态的改变。这包括变性，聚集，沉淀，吸附（见表1）。沉淀被用在这里是指不溶性而不是不溶性聚集体形成。 我们关于所有蛋白降解途径的知识有很大提高比20年前。因此，这篇文章的重点是自从1989年以来取得的进步。另外还有降解过程，及讨论不够详细的主题。这些已列入作为如下独立的章节。举例来说，已经有许多关于各种辅料增加蛋白质构象稳定性许多文章，无论是在水溶液和干燥状态下。此外，简要概述了蛋白质稳定性的方法，包括各种干燥法，化学改性，并定点突变。最后，以化学和物理之间的相互关系提供了不稳定。化学不稳定性去酰胺20年前，已经了解去酰胺化，它包括天冬酰胺和谷氨酰胺侧链酰胺的水解，这是蛋白及肽普遍的降解途径。它仍被视为是肽和蛋白质最常见的化学降解途径。从监管的角度来看，去酰胺化的发生于杂质的生成和产物降解有关。另外，其可以增加免疫原性。 在原来那篇综述文章的时候，药物相关蛋白去酰胺化的例子很少，其中包括人生长激素（hGH），胰岛素，-球蛋白，血红蛋白。此外，外在因素如pH，温度，离子强度的影响也已经被知道。自那时以来，现在可用的关于去酰胺化及相关反应的信息大幅增加，可以在一些杰出的综述文章及相关书籍中找到。可以在 上找到相关主题。天冬酰胺的去酰胺化天冬酰胺去酰胺化的过程是指在酸性条件下天冬酰胺侧链氨基直接水解形成天冬氨酸。在这种情况下，去酰胺是受酸的催化作用。同样，谷氨酰胺残基转化为谷氨酸（正如在下面将详细描述）。但是，这个机制是很少看到，由于pH值必须小于3。在中性至碱性溶液（即大于pH6），该机制的变化到一个分子环化反应。第一个步骤是天冬酰胺相邻的氨基酸残基的羰基N+1发动对天冬酰胺侧链的亲核攻击。（如图1）这一步是碱催化，因为骨架上酰胺质子结构的抽象或部分抽象使的氮更加亲核，加速了反应。一个环化的酰亚胺（也称为丁二酰亚胺或Asu）是由氨的损失所形成的中间体（图1）。由于氨是一种气体，通常在溶液中不保留，这一步是不可逆转的。虽然Asu中间体往往能够作为降解产物被检测到，它很容易水解，在水溶液中形成ASP和isoAsp产物（图1）。在Asu五元环中间体的形成被认为是天冬酰胺去酰胺真正的原因这比谷氨酰胺去酰胺化更流行，因为五元杂环比与谷氨酰胺去酰胺产生的六元环更稳定。因此，在原天冬酰胺残基位点，去酰胺生成两个降解产物（ASP和isoAsp）。随着消旋的可能性，可能有四种产物形成（L-Asp, D-Asp, L-isoAsp及 D-isoAsp）。现在已经知道，消旋不会明显的发生在任何Asu中间体，正如先前认为的。相反，它似乎是一个平行的降解途径。Dehart 和 Anderson已经详细的对分子环化的动力进行了描述。通过环化分子对消旋缺乏的观察，已经产生较大的蛋白。天冬酰胺去酰胺化对蛋白序列的影响有些关于去酰胺对主要序列影响的工作，1989年已经做了，特别是认识到天冬酰胺-甘氨酸结构是特别容易去酰胺。随后，Robinson 及其同事对去酰胺化对序列的影响做了细致的研究。最终，他们的实验结果形成了有效的预期计划。在一般情况下，两种趋势是显而易见的。首先，因为天冬酰胺残基发生更快的去酰胺后氨基酸具有更小的侧链，大概是由于最初的环化反应的空间位阻的不足。二，随后有侧链氨基酸，可作为捐赠者往往作为氢键，以加快反应，可能是由于分子内氢键结合天冬酰胺的羰基氧，使之更加亲电，从而有更多反应亲核攻击。因此，不需要关注每一个天冬酰胺残基的去酰胺化。对于制药科学来讲，只有那些后面连着小的或氢键给予残基（例如，丝氨酸，天冬酰胺，或ASP）的天冬酰胺才会在一定时间范围内表现出脱酰胺化。例如，Chelius等发现在单克隆抗体中的天冬酰胺脱酰胺化发生在天冬酰胺甘氨酸和天冬酰胺天冬酰胺序列中，而Xiao和Bondarenko发现脱酰胺化发生在天冬酰胺天冬氨酸序列中。总体而言，天冬酰胺甘氨酸是最活跃的序列，符合Robinson 和 Robinson的图表（表II）。通常，前面的残基很少或不会对脱酰胺化的机率产生影响，至少在溶液中是这样的。Li等人发现蛋白在固体状态下谷氨酰胺或谷氨酸在该位置会表现出加速脱酰胺化反应，大概是通过增加周围的天冬酰胺残基的水合起作用。在酸性pH值时，对于脱酰胺机制不涉及环酰亚胺的形成。相反，经过质子化了的酰胺侧链直接被水亲核攻击。因此，在酸性条件下氨基酸序列就不是影响脱酰胺化的主要因素。高级结构对天冬酰胺脱酰胺的影响1989年，高级结构对脱酰胺效率影响的能力才刚刚开始受到关注。1988年，Kossiakoff证明，肽链的灵活性会影响去酰胺率。其他研究组通过对一种给定的球蛋白结构中分散的天冬酰胺的脱酰胺化率进行检测，也得到了相同的结论。此外多项研究表明，在一些二级结构中的天冬酰胺表现出缓慢的脱酰胺化率。这些二级结构有-螺旋（33,34），-折叠（35）和-转角（36,37）。一个在序列中的天冬酰胺所处的三维结构信息可以增进对其脱酰胺率预测的准确性。此外，三维结构的改变会影响去酰胺率。例如：在胰岛素-螺旋结构中的AsnB3表现出缓慢的脱酰胺化。单克隆抗体中的脱酰胺化我们关于单克隆抗体的稳定和结构方面的知识，在过去的20年里呈指数增长。这包括那些重要的分子药学的脱胺基化研究。在一般情况下，单克隆抗体的脱酰胺化是可见的异质性、化学不稳定和其他种类的糖基化的差异有关。1992年，Kroon等人报告了，第一个上市单克隆抗体产品OKT- 3发生脱酰胺化。随后的十年里出现了零星的单克隆抗体脱酰胺的报告。在过去的5年中，在单克隆抗体脱酰胺得报道数量已大大增加。一些报道关注外在因素的影响，一些报道的重点是序列的影响，而另一些重点放在利用某些类型的质谱分析方法，监测和量化脱酰胺化。这些研究为监测和量化任何蛋白质或肽的脱酰胺化提供了坚实基础。另一些研究组报告说，使用的电荷分离方法来检测和量化肽和蛋白质的脱酰胺化，而另一些研究组用反向高效液相色谱法，肽图谱和拉曼光谱去检测脱酰胺化。不过，后者非常不敏感，需要脱酰胺化超过10。长期储存的人类单克隆抗体导致脱酰胺在天冬酰胺和谷氨酰胺残基处，还包括其他化学不稳定性，例如碎片和pGlu形成。那些其他的降解途径在下文中进行讨论。这似乎是真实的是，在较小的肽和蛋白质中控制去酰胺率的因素（主要序列，温度，pH值等），同样在单克隆抗体降解是重要。其它药用蛋白的脱酰胺化除了单克隆抗体脱酰胺化的大量工作，其他一些研究也描述了相关肽和蛋白药品，包括疫苗和抗原蛋白的脱酰胺化。这些研究见表三。在一般情况下，任何蛋白质或肽包含ASN -XAA序列，随着时间的推移就容易脱酰胺。脱酰胺化速率的控制一些减慢脱酰胺化的方法已经被制定了。最主要的方法是控制pH。天冬酰胺的脱酰胺化速率曲线呈现v字型，当pH在36时速率最小。此外，作为一种化学反应，它显示典型的阿伦尼乌斯规律。实验的蛋白或肽在实验温度范围下不改变其结构。 有趣的是，通过改变蛋白的结构可以减慢脱酰胺化。在1989年，/角度就被认为是发生分子内亲核攻击，进而形成Asu中间体的条件。和分别是指为中CN键和C(O)-C的旋转角。因此，限制了肽链的折叠，并减慢了脱酰胺化。这是减慢脱酰胺率明确和无可争辩的高层次结构的基础（见上文）。这是通过排除溶质可以改变的多肽链的折叠性。增加蔗糖可以使肽形成-转角构象，从而减缓脱酰胺化。糖和多元醇压缩乙醇脱氢酶的结构，从而减慢脱酰胺化。同样，如果去除包含组氨酸的蛋白的C端氨基酸，将导致脱酰胺化。这也许是因为影响了蛋白的高级结构造成的。最后，我们可以想像，采用较低pH酸度配方脱酰胺率将放缓。虽然这些相同的溶液，还可以影响结构，粘度和溶剂介质，所以这种影响可能并不完全是由于酸碱性造成，所以非水溶剂已经被采用。模型肽的粘度的影响已被描述。同样，电介质和粘度对单克隆抗体Asp异构化的影响已经测定。在这种情况下，提高化学稳定性是以降低稳定的构象为代价的。因此，使用非水溶剂，对于多球蛋白这种办法可能不是可行的，但对于肽是可行的，在溶液中肽的构象并不重要，重要的是保持生物活性。1989年之前，据了解，的已经知道某些缓冲液表现出一定减缓催化天冬酰胺脱酰胺的作用。大部分缓冲液已经被证明出现一定缓冲能力程度。因此，限制缓冲液的量可以减缓脱酰胺速率。在过去的20年中，这个问题较少的被研究了。Tyler-Cross和Schirch研究表明，模型肽脱酰胺一般是碱催化，但他们并没有对特定碱性催化剂进行研究。所以，除了一些关于缓冲作用的观察，脱酰胺催化机理方面的研究很少。至于最近对缓冲作用的观察，Girardet等人报道说pH=7.4时-乳清蛋白在磷酸盐缓冲液下的脱酰胺速率要高于在Tris缓冲液中的速率。Zheng和Janis进行了单克隆抗体脱酰胺缓冲液影响的详细研究，测试了酒石酸，柠檬酸，琥珀酸，磷酸盐。他们发现，柠檬酸是最好的选择，而pH值必须小于5。固态下的脱酰胺化Lai 和 Topp已经综述了在固体状态下肽和蛋白质化学降解的倾向。概括而言，这里描述的许多反应，包括固态多肽脱酰胺化已经被观察到。例如，固态下环形和线性肽的脱酰胺化速率被分析。和在液态下相比，在固体状态下脱酰胺速率也可以被发现。最后Houchin 和 Topp最近报道了肽和蛋白质的化学降解，包括微球包裹中的脱酰胺化。谷氨酰胺的脱酰胺化在过去20年中，我们关于谷氨酰胺脱酰胺化的了解得到了惊人的提高。谷氨酰胺的脱酰胺化不像天冬酰胺脱酰胺那么普遍。天冬酰胺残基环化形成一个五元环。对于谷氨酰胺，中间体是一个六元环，它没有像五元环那么良好的热力学基础。当然，谷氨酰胺脱酰胺化是在1989年才被发现。因此，因为很少有报道，所以在我们之前的综述中并没有讨论。直到目前，Joshi 和Kirsch已经报道了关于在肽中的谷氨酰胺脱酰胺化的详细机制研究。在大蛋白中的谷氨酰胺脱酰胺化也已经有了一些报道，如在晶体蛋白和单克隆抗体中。脱酰胺化的理论研究除了对肽和蛋白脱酰胺化的大量研究外，一些脱酰胺化理论研究也已经开展。这些包括分子动力学（MD）模拟和从头计算。值得注意的是，Radkiewicz等。 2001年发现的骨架的构象（例如/角度）影响NH集团的酸度。甘氨酸能够提供更多的构象空间，显示增加NH酸度，这将有助于提高酰胺去酰胺率。因此，天冬酰胺甘氨酸序列提高反应速率，可能并不完全由于空间位阻不足导致分子内的亲核攻击。琥珀酰亚胺的形成在一般情况下，脱去酰胺基的形式（Asp和isoAsp），以及相应的环化酰亚胺（Asu）中间体，已分离和鉴定，尤其是在肽中。单克隆抗体的环化酰亚胺中间体已多次分离和描述。来至Amgen的研究组采用的疏水作用层析（HIC），阳离子交换色谱（CEX）和液相色谱-质谱（LC- MS）。来鉴别贮存在高温下的单克隆抗体，尤其是IgG2s中Asu的形成。主要降解产物似乎是环化酰亚胺（Asu）位置在轻链（LC）的30位置。 其他研究也报道发现Asu的形成是在具有102个残基的重链的LC32位置。琥珀酰亚胺形成，在其他系统已经被报道。例如，人生长激素的受胁迫样品中在AspGly位点形成琥珀酰亚胺产物，它已经被用反相高效液相分离和定量。类似的降解胶质细胞源神经营养因子中也有报道，其琥珀酰亚胺产物形成在96位置。退化形式的蛋白的结构和药代动力学与活性天然蛋白质是相同。溶菌酶也有在AspGly位点形成琥珀酰亚胺产物的报道。天冬氨酸的异构化一旦环化亚胺的中间形式，它可以打开或天门冬氨酸或异天冬氨酸产品的形成（图1）。这种机制表明，天冬氨酸本身可以环化形成琥珀酰亚胺（Asu），从而使天冬氨酸向异天冬氨酸转化。这个反应被称作天冬氨酸异天冬氨酸互变，但是通常情况下是天冬氨酸向异天冬氨酸转化。对于脱酰胺化和天冬氨酸异构化的限速步骤是相同的，其速度就是被环化亚胺中间体的形成所控制。因此，同样的方法可采取去减缓每个反应。换句话说，通过pH达到对缓慢脱离子化的最大控制。脱离子化可导致环化。 早期在这方面的研究指出天冬氨酸异构化的质子形式，例如：当pH在5以上时反应速率较低。事实上，pH值高于8，反应与pH值和缓冲液浓度无关。pH值低于3，只水解是被观测的。C-端氨基酸的大小阻碍了中间形成环化酰亚胺，天冬氨酸异构化从而减缓。立体结构影响环化率与脱酰胺化。自从最初的综述被刊登，在不同的系统中的天冬氨酸异构化已经被报道，特别是在单克隆抗体中。一些同分析单克隆抗体脱酰胺化相同的液质联用分析方法被用到分析天冬氨酸异构中。单克隆抗体的两条降解途径被观察。特别是天冬氨酸异构化已经被报道发生在轻链的32位和重链的102位。对于在单克隆抗体中的天冬氨酸天冬氨酸序列，两个天冬氨酸异构化和天冬氨酸辅助水解也被关注。消旋作用（具体讨论见下文）与天冬氨酸的协同作用已经被关注，同样其与脱酰胺关系也被关注。其重点是这些降解途径的内在联系是怎样的。除单克隆抗体以外感兴趣的其他药用蛋白发生天冬氨酸异构化也已经报告。例如:神经生长因子第93位的天冬氨酸异构化，发生在其降解途径中，而白介素-11的第45，47位天冬氨酸异构化。Dette和Wtzig 能够用毛细管电泳方法分辨重组水蛭素的天冬氨酸异构化产物异天冬氨酸。pH和温度的外界条件控制（见上文）减慢天冬氨酸异构化的策略还没有被报道。通过排除溶质的方法来保证单克隆抗体的构想稳定性，确实降低了其化学稳定性，因为加速了天冬氨酸异构化。据推测，改变下一位的氨基酸（N+1位氨基酸）可以减慢反应速度，但还没有这一类的详细报道。天冬氨酸的水解作用在As/Asp残基处第三种和降解有关的反应是肽骨架的天冬氨酸水解作用（也被认为是蛋白水解）。不幸的是，关于这方面的可以报道非常少，而且大多数可以追溯到1983年。因为此反应同样涉及分子环化，所以蛋白水解同样表现出对pH和缓冲液催化作用的敏感性，这和脱酰胺化相似。该机制被Joshi和Kirsch详细的描绘了，亲核攻击发生在肽骨架上的天冬氨酸的质子化羰基的离子侧链。会产生酸酐类物质和释放肽链N-末端部分。这有一些关于初级结构对天冬氨酸水解的影响的可靠的信息。丝氨酸或酪氨酸在N+1位的出现能够加速反应。同样，如果有丝氨酸或缬氨酸在N+1位出现可以加快水解，这和天冬氨酸的异构化有关。其他相似的水解反应被报道。例如天冬酰胺脯氨酸序列在氨的存在下显示出显著的不稳定性。在神经生长因子中的Asp60Pro61序列相似的降解过程被报道。在一种P物质拮抗剂（一种生物活性肽）中脯氨酸和缬氨酸两端的肽键被发现有水解现象。铰链区水解肽主链水解已经被观察到，即使在抗体的天冬酰胺酶不存在时。最常发生这种反应在抗体的铰链区，因此它被称为铰链区水解。但是，它也可以发生在的CH2- CH3的界面。通常，它在IgG1s发生，因此这个反应有可能影响肽链的灵活性。这种反应明显是来自酶水解，可以在这一区域产生抗体。这一过程也有很多详细研究报告。第一项研究报告卵裂在小鼠单克隆抗体的铰链区，表明反应可以发生在碱性条件下。破碎化，以及与其他化学不稳定性一起，在报道OKT3治疗，这是小鼠IgG2a的抗体。利用MALDI - TOF和毛细管电泳，Alexander and Hughes发现铰链区水解发生在嵌合小鼠/人的IgG。这种反应一般性质通过科尔多瓦表明。表明，铰链区水解发生在四个不同的人类IgG1s中。所观察到的断裂图形表明，水解反应不是针对特定的肽键，但在一个狭窄的范围内出现的残留物。在这种情况下，水解仅限于重链序列丝氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，苏氨酸，苏氨酸。同样，铰链区水解说明，在对单克隆抗体的质谱研究及检测过程也以被报道。而链的灵活性显得很重要，它最近被证实抗原结合片段的构象不稳定导致的铰链区水解频率增加。 对于铰链区水解pH值率剖面是V形，pH值在6附近最低。pH高于6时这个速率线性增加。由Cordoba等人的研究表示，EDTA和蛋白酶抑制剂对水解率不会有影响。除了如上所述铰链区水解，出现了在同一区域金属辅助单克隆抗体水解报告。在这种情况下，螯合剂有些能缓慢降解。色氨酸水解 除了这些广为人知的退化过程，其他官能团水解也很敏感。例如，已知的色氨酸侧链水解。主要降解产物是犬尿氨酸，这比色氨酸本身波比更长（450纳米）发出荧光。犬尿氨酸和相关物质也可以形成色氨酸氧化降解反应（见下文）消旋作用和-排除 这两个降解途径是相互关联的，因为最初的步骤是一样的：对-碳（图2）氢的去质子化。通常情况下，C - H键没有什么酸碱反应，但是氨基酸的C - H键也有一些酸性的特性。因此，消旋通常是一个非常缓慢的过程，很慢，它可用于产生最新假象。在体内许多蛋白质已有外消旋报告，如从眼睛晶状体的晶体蛋白，肌肉髓鞘。 通常，消旋作用发生在天冬氨酸残基，虽然有报道在小鼠溶菌酶天门冬酰胺有消旋作用（139）。为什么这个残留更多的反应尚不得而知。通过McCudden和Kraus综述可以发现氨基酸的消旋更广泛的总结。 一旦C- H键电离，重组可导致消旋（图2）。另一方面，由此产生的碳负离子可以重排，并从放射出的-碳离去基团，-和-碳之间生产双键。这是-消除。在高温下，在多数蛋白质中半胱氨酸残基-消除容易产生。在药品蛋白之中， IL-1受体拮抗剂和胰岛素的-消除已报道。它也表明，-消除发生在铰链区水解的条件下。二酮哌嗪生成 另外描述了一个N -末端环化过程的一些细节。请注意，N-末端氨基酸组可以是一个有效的亲核集团，尤其是pH值高于8。如果胺袭击的第二个肽主链的羰基，二酮哌嗪（DKP）环就形成了。 到在长期储存和肽合成通过DKP生成一种肽或蛋白质N-端的降解的形成中已被普遍观察。 这种反应是最初在肽中观察到的，其中的DKP环可以重新排列或前两个氨基酸损失或在链中的位置逆转。DKP形成的程度取决于在游离碱形成的末端氨基的百分比。在酸性条件下，反应相当慢，与pH值无关。 DKP形成的动力学分析在肽的已经证实了pH值、缓冲液种类、浓度与温度的影响。第一段速率常数随缓冲液浓度通常会增加，除了碳酸盐，没有显示出浓度依赖性。DKP形成的降解的原因，显示在人生长激素和P物质中观察为N-端不均一性负责。进一步DKP生成的反应动力学最近被证实了。 在某种程度上，DKP的形成导致在肽链的长度减少，也算是一种蛋白水解反应。DKP的重排从前两个氨基酸通过肽键的C端切割到第二个氨基酸，减少了两个氨基酸的质量产生一种蛋白的分子量。在溶液中，DKP的形成是常见的N-末端序列氨基甘氨酸- Pro的蛋白质。焦谷氨酸的形成虽然在之前有一些参考文献展示了这个反应，但在1989年的综述中并没有被涉及。这个反应涉及N-末端的谷氨酸残基（有时也为谷氨酰胺残基）形成五元环的结构（图3）。换句话说，焦谷氨酸的形成机制不涉及酶的参与，其和二酮哌嗪（DKP）的形成机制相似，是多肽链N-末端胺的亲核攻击照成的。在这种情况下被攻击的对象为N-末端的谷氨酸侧链的羧基基团，脱下来一分子水（图3）。因为单克隆抗体的轻链的N-端第一个氨基酸经常为谷氨酸，有时候重链也如此，所以这个环化反应经常发生在单克隆抗体中。通常，焦谷氨酸的检测使用质谱。在长期贮存的单克隆抗体中焦谷氨酸含量被发现提高的。在某些情况下，在重链N-端的焦谷氨酸转化已能被定量分析。在成骨蛋白-15的变种中也有焦谷氨酸的形成。做为一个涉及亲核攻击的反应，焦谷氨酸形成的速率明显呈现pH依赖。尽管这个反应的数据相比其他依赖pH的水解反应非常有限，但这个反应的pH依赖性已经被报道。缓冲液的性质对焦谷氨酸的形成率有一定的影响。模型肽在磷酸盐中更快的形成环化。在较低的pH值，醋酸似乎是减缓焦谷氨酸形成的最佳缓冲物质。最后，有报道说N-末端的谷氨酰胺残基和谷氨酸残基一样可以形成焦谷氨酸，虽然其速率要慢于谷氨酸。蛋白的糖化作用蛋白糖基化发生在一个存在还原糖的孵育环境下。这个反应发生在典型的赖氨酸的侧链和还原糖的羧基之间。这导致希夫碱的形成，它能引起重排产生很多稳定的产物。总之，这些相关的反应引起颜色变化被称为美拉德反应或非酶褐变。美拉德反应可以发生在固体状态下，也可以发生在水溶液中。例如DNA酶I的糖基化发生在干状态下。糖基化在体内和在体外同样发生。事实上，在体内血红蛋白糖基化的程度是糖尿病的独特标记。最近对糖基化一些细节的机制进行了概述。尽管糖基化的发生并不影响某些抗体的亲和结合力，但其能够影响抗体的功能。但是，它可以影响分子整体的稳定性。例如，美拉德反应可能会导致很多不稳定的肽键，如松弛。这种降解途径是科学家倾向于避免使用还原糖（葡萄糖，乳糖，果糖，麦芽糖）配方主要原因之一。然而，还原糖的产生也可以来自于蔗糖的水解。Smales等人证实了当提高温度时蔗糖可以使病毒蛋白失活。相似的，在贮存研究中，蔗糖基质中的糖基化也被观察到。然而，这要求提高温度和酸性pH。值得注意的是，海藻糖糖苷键似乎比蔗糖的强很多，因此海藻糖配方很少，甚至根本没有。另外，低的pH会导致蔗糖的不稳定性和糖基化。事实上，在pH=2.5时蔗糖的糖基化发生速率要比海藻糖快2000倍，因为蔗糖可以水解产生葡萄糖和果糖。尽管精氨酸残基和N-末端残基也可以发生，但糖基化位点经常在赖氨酸残基处。在单克隆抗体中某些赖氨酸要比其他赖氨酸残基容易发生糖基化。尽管碱性和溶液的可进去性看起来很重要，但提高反应性的基础还不清楚。免疫球蛋白2和免疫球蛋白1中的糖基化均被发现。一些缓冲液可以催化糖基化已被观察到，至少-球蛋白在磷酸缓冲液中是加速糖基化的。然而，缓冲液催化作用并没有对牛血清蛋白或卵蛋白进行观察。氧化随着上述水解反应，蛋白质的化学降解是由于氧化作用是其他主要降解过程发生的这种情况。任何蛋白质，包含组氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，酪氨酸和色氨酸的氨基酸，被潜在的破坏通过许多活性氧（ROS）反应。在蛋白质侧链氧化反应过程中可能出现的任何蛋白质的生成，纯化，配制和贮存期。 而我们对于蛋白质氧化引起的化学降解的认识已经大大扩展了，在过去的20年里。氧化率受内在和外在两个因素影响。内在因素包括肽链的活性和蛋白质整体结构。此外，外在因素，如pH值和缓冲液，也会影响蛋白质的氧化率。 蛋白质和肽氧化作用通常分为两大类：特定的（即，金属催化氧化或MCO）和非特定反应，其中包括光氧化作用和自由基级联。后者来自许多原因，主要导致甲硫氨酸和色氨酸氧化。甲硫氨酸氧化甲硫氨酸（Met）残基的化学稳定性已经被证明重要的稳定的构象和蛋白质功能。不同水解反应，MET氧化反应与pH值几乎无关的。因此，人们无法通过调节pH值控制氧化反应。甲硫氨酸的氧化作用，使用ROS完成。即使氧气分子是足够甲硫氨酸侧链转换相应的亚砜。我们必须牢记，在水溶液中与氧反应包括氧气在水中的溶解度随温度的变化，从而随着温度增加而降低。因此，尽管甲硫氨酸氧化通常如Arrhenius规律，反应可能会增加在冷的状态下氧的溶解度高于常温。由于这些反应是自由基传播，它必须是认识到有许多潜在来源的自由基，包括器皿和辅料（见下文）。 即使在1989年审查时，可知不同的甲硫氨酸残基以不同的速率氧化。然而，很少有人知道以后的观察。这似乎是在控制蛋白质的氧化率方面最重要的，是残留溶剂的特定无障碍程度，使氧化种类容易攻击侧链。因此，甲硫氨酸残基是溶剂充分暴露将会表现出最大的氧化率，而侧链将非常缓慢氧化。换句话说，活性氧一定能够轻易进入侧链氧化进行迅速。这也意味着，虽然蛋白质有一些能力的，保护特定的基团以防止甲硫氨酸氧化，因为他们的能力是隐藏蛋白质内部的侧链，肽没有这种抗氧化能力保护自己。肽缺乏更高的结构，在全部时间里使氨基酸得到充分溶剂暴露，造成甲硫氨酸最大速率氧化。 因此，虽然溶剂趋近性是控制氧化率的关键，它可能不是唯一的重要因素。一些证据也提出了将甲硫氨酸氧化率与构象稳定性连接或相关。此外，蛋白质解链温度附近，可以观察到非Arrhenius动力学导致大规模的结构变化。单克隆抗体甲硫氨酸残基氧化已被广泛报道的，尤其是在Fc区。在一项研究中，不同的被氧化残基的正确分布是蛋白质被较长时间的储存或遭受的T BuOOH。这说明了一个事实，虽然强制氧化研究在成分筛选方面是有价值的，他们可能不会产生产品的精确分布在长期贮存中。金属催化的氧化反应当具有氧化还原活性的金属连接到蛋白上金属催化的氧化反应将发生。连接经常发生在甘氨酸，天冬氨酸，组氨酸和半胱氨酸处。这些氨基酸，组氨酸和半胱氨酸对氧化损伤是敏感的，因为在反应发生之前，在金属中心产生的活性氧没有分散很远。机理研究表明，金属离子和过氧化物通过芬顿型反应形成自由基。组氨酸的氧化产物有多种形似，但2-氧代组氨酸为主要的氧化产物。2-氧代组氨酸已经被在人松弛素，1-蛋白酶抑制剂和人生长激素中发现。色氨酸的氧化即使在没有光线的状态下，色氨酸残基的氧化也可能发生。主要产物为犬尿氨酸衍生物，特别是当铁为基质的氧化剂被使用时。色氨酸的氧化已经在单克隆抗体中被发现，它带来了一个新的峰的出现，无论是排阻色谱还是反相-高效液相色谱中。光氧化1989年，在一些关于血红素蛋白吸收可见光波长区域的光的报道被报道之前，很少有人知道蛋白质的光解降解。从那时起，暴露于光下已经被确认为化学降解的潜在来源，如ICH指南Q1B中反映的。最近，发表了一些评论描述光的照射，降解机制和可能减少光引起的损害的方法。当蛋白被暴露于光下的时候，将导致那些对光氧化反应敏感氨基酸的化学氧化，如：色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸。光导致的氧化反应途径开始当一个光子被吸收，从而导致进入一个电子激发态。具有激发态的氨基酸有一些不同的降解途径产生不同的降解产物。现在看来，光降解，特别是光氧化是一种常见的蛋白质降解途径在很多蛋白中，如在发现牛奶中的许多蛋白质存在光降解。色氨酸对300nm以上波长的光非常敏感，它就像一个这个波段光的吸收容器。最近，一些关于药用蛋白的光降解的例子已经被报道，大多数都涉及色氨酸的光氧化。单克隆抗体中的色氨酸氧化会导致失活和在高浓度状态下的变色。高浓度抗体配方的氧化速率表现出pH依赖，在碱性条件下，可能产生可溶性的聚合。另一种单克隆抗体MEDI-493，当被紫外线照射，而引起的色氨酸氧化，表现出结合活性和生物活性的损失。另一项研究测定了三种不同单克隆抗体被暴露在254nm光下所造成的影响。研究表明三种抗体都表现出了聚合度的增加。通过吸收测量，圆二色谱（CD）和荧光测定发现，重组人干扰素-2a当暴露在紫外线辐射时结构发生了改变。当色氨酸吸收近紫外光被激发时，它会影响其相邻的氨基酸和破坏二硫键。 色氨酸的光电离能够通过电子转移降解二硫键，导致蛋白质的化学和物理降解。在不同蛋白中的研究已经证实，无论是在液态还是固态状态下，色氨酸光激发状态降解二流键的能力。请思考光氧化反应的最后一个说明。聚山梨酯可以使光氧化变得容易，据山梨酸（商标名称也被称为Tweens）是一种光增强子，它可以导致更多的单态氧产物。因此，蛋白氧化的提高并不是单单因为表面活性剂的氧化不纯。半胱氨酸的氧化 虽然半胱氨酸残基涉及到的主要氧化过程是二硫键的形成（见下文），它们还有其它的氧化过程。例如，因为一个氧原子的加入，它们可以形成sulfenyl类物质，和甲硫氨酸被氧化成硫氧化物的途径相似。乙醇脱氢酶中巯基的氧化可以导致活性的丧失。此外，有越来越多的文献报道含硫物质的形成，硫基自由基，可以从光解引发或形成二硫键自身分解。抗氧化防护依据氧化的机制，有一些防止蛋白氧化的方法已经被应用。蛋白被暴露于紫外线下所照成的损伤可以通过调整二次包装和添加剂配方来有效降低。另外，用添加添加剂的策略对于缓和氧化还比较有限。尽量通过减少小瓶顶空的方法来降低蛋白暴露于氧气中机会似乎是有效的。对于甲硫氨酸的氧化是非常重要的。限制氧化敏感的侧链的溶剂可接触性是一个可行的策略，它已在工作枯草杆菌蛋白酶和碱性磷酸酶中被证明。另外，蔗糖可以提升因子-VII的氧化速率，但原因还不清楚。而像甘露醇等组份已经做为自由基的清除剂被报道，但并没有报道称其可以减缓药用蛋白的氧化。然而，糖类和多元醇在高浓度时可以络合金属，因此可以缓解金属催化的氧化损伤。可以采用添加添加剂的方法，使这些活性成分取代那些有氧化活性的组分。这对于单独的甲硫氨酸，N- Ac-Met，硫代硫酸盐和N-Ac-Trp是一种有效的方法。对金属催化的氧化反应的控制已经很完善，比如通过添加EDTA。螯合剂可以降低金属的活性。请注意，当pH值低于5时EDTA的亲和力明显下降，这是因为它的羧基侧链质子化造成的。值得注意的是，像抗坏血酸等的抗氧化剂，虽然可以有效地抑制脂质过氧化反应，但是实际上增强了过渡金属的活性和金属催化的氧化反应的损伤。否则，对于氧化，尽量减少原料药和辅料的使用水平是提高储存稳定性的又一因素。许多辅料中包括聚山梨醇酯类和聚乙二醇等氧化杂质。一篇关于辅料中的过氧化杂质的综述已经发表。二硫化物干扰 半胱氨酸残基可以形成二硫键在很多年前就被知道。而他们在聚合中也扮演了一个重要角色，通过共价交联（见下文），它们能够影响整个蛋白的构想，因为发生了二硫化物分子的重排。如上所述，半胱氨酸残基的游离形式的去除可以大大缓解二硫化物干扰和交换。尽管化学键的数量和形式再重排后是相同的，因为化学键已经被打断和连接，这也应该被视为一种化学不稳定性。一些文章已经报道了目前在单克隆抗体中发现的二硫化物亚型的形式。尽管反相-高效液相和液质连用已经报道可以检测和定量分析二硫化物，但对它的检测和定量还是首选SDS毛细管电泳。IgG2s中的二硫化的位置不同可能影响其功能不同。这表明我们对复杂分子的分子细节的理解的变化时如此的迅速。物理不稳定性物理不稳定性是涉及任何关于蛋白的物理状态发生改变而化学组分并没有改变的过程。这篇文章和1989年的综述文章相似，将关注四个过程：变性，表面吸附，聚合和沉淀。对于写这篇综述的目的主要是聚合问题，聚合是蛋白可溶聚合的一种形式，表现为肉眼可见的蛋白析出。正如下文所述，沉淀可能会或可能不会与聚合有联系。这可能仅仅是由于蛋白质超过其溶解度所造成。这四个主题都十分广泛，而且不断发展。因此，其目的不是提供对各个议题的全面的概述。而是，展示在过去20年左右对蛋白质的稳定性每个领域中我们知识的进展。变性变性被解释为在大多数蛋白中球蛋白和三维结构的消失。球蛋白结构被认为是自然状态，尽管它被认为是复杂的微观结构。相反，展开或变性是蛋白的物理结构发生变化，而化学组成并没有改变。变性涉及蛋白二级或三级（也可能是全部）结构的丧失。热变性提高温度可能是导致蛋白的球状结构丧失的最普通的胁迫条件。温度与蛋白展开情况的函数曲线是S形，其中点对应的温度值被作为TM值（表示熔化温度）。在一般情况下，可以想到Tm值的增加反映了构象稳定性的增加。假设热量的转移从折叠状态到展开状态在相似程度下是可逆的，那么这可能是正确的。然而，在过去20年来，可逆性已被证明可能是比Tm值更好的贮存稳定性指标。因此，构象稳定的其它措施可能是成分决定的引导，像化学变性的研究（见下文）。大多数热变性是不可逆的，因为展开的蛋白分子发生了快速的聚合。在使用DSC进行热变性研究时，这种行为是经常被观察到的。自从Sanchez-Ruiz等人的报告使用的扫描速度为Tm依赖的以后，已经出现了许多报告利用DSC通过改变扫描速率来探讨聚合率。问题是这假设了一个确定的动力学。最近，人们已经为发展更多的动力学图表做出了努力（例如参考文献263，264）。而他们去除了以前方法的局限性，数学和图表的结合是非常棘手的。冷变性冷变性的过程是在1961年被发现的，现在仅有很少的文献报道了冷变性。这是因为大多数蛋白冷变性是在远远低于冰点的温度下出现的。这意味着，这就蛋白质变性而论是不重要的。然而，我们必须认识到的最大冻结浓缩状态的玻璃化转变温度（Tg）一般低于-20，即使有稳定剂（如糖）在场的情况下。这意味着蛋白在20C冰冻状态下时，有一定的流动性，类似于流体溶液。因此，对冷变性的潜力可能比以前认为的更大。例如，最近关于IL-1ra的研究发现其冷变性温度约为-10度，因此其在冻结状态下非常容易受影响，除非贮存温度远远低于 30C。化学变性另一种展开蛋白的普通方法是添加助溶剂，它可以使蛋白失去球状结构。到目前为止最常见的有尿素和盐酸胍（GnHCl）。以分析S形曲线来确定展开的自由能(Gu)已经被在 Pace和其同事发表的综述中总结的很好了。对于热失活和化学失活之间的关系有着不同的意见。例如，一个研究组发现它们很好的关联，而另一个研究组的结果却恰恰相反。结果的不同可能是因为蛋白大小的多样性，可逆性轻微的不同或者转化前和转化后的温度依赖的不同。破坏和扰乱这些化合物的球状结构的机制仍在紧张调查中。即使在过去的几年里，一些文章报道了关于助溶剂破坏自然状态或稳定展开状态。另外，尿素表现出阻止球蛋白自然状态所需的疏水合拢。这件事情是清楚的，和排除溶质不同，助溶剂和蛋白结合来降低它们的化学势。因此，展开状态有一个更大的表面积和自然状态相比，而展开状态的化学势要低于高级结构。当化学势降到自然状态以下时蛋白展开。据报道，在高浓度的尿素或盐酸胍中氨基酸侧链的pKa会改变0.3到0.5个单位。这可以通过升高静电排斥来影响蛋白结构的稳定性。 压力诱导的变性另一个领域是在1989年几乎是未知的，这就是使用高压开展蛋白质的想法。直到现在，一些关于这个主题的很好的文章已经被发表。通常情况下，超过2000bar（2000大气压）的压力是必要的，甚至多达4000bar的压力经常需要。最近高压诱导变性的分子基础才被描述。此外，通过渗透剂的能力或排除溶质来提升蛋白抗压力诱导变性的稳定性。大体上，压力诱导变性表现出完全的可逆性，不像其它胁迫导致的蛋白展开。应该指出的是，中间的压力（1000-1500bar）可用于分离聚合，并允许聚合蛋白质重新折叠。固体状态下的变性即使蛋白在固体状态下，提高温度也可以发生变性。对于大多数在固体状态下的变性温度都是很高的，经常在150C以上。其Tm值像Tg值一样，呈现出一定范围，这与水分含量有关。关于冻干蛋白的变性的详细讨论在最近被发表，它与Tg值和其它玻璃化状态的行为有关。例如，生长激素的变性发生在Tg值以上，是不可逆的。本质上变性蛋白在过去的十多年里，人们认识到在自然状态下有很多蛋白以展开的状态存在。（例如随机卷曲）。最近的研究表明有些蛋白是本质上变性蛋白（IDPs）。超过50种这样的蛋白被鉴别，并已经被报道出来了。本质上变性蛋白包括一些人们感兴趣的药用蛋白，特别是酸性成纤维细胞生长因子超家族。这些蛋白可以在没有球形折叠的结构下发挥其功能。通常意义上说，在这些系统中变性是不适用的。聚合自从1989年的综述文章发表，蛋白聚合在蛋白稳定性这个领域中变成了一个热门的讨论和研究的问题。所以，这个领域有大量的研究文献和杰出的综述文章被发表（例如，参考文献294-299）。因此，在本文中只做简单的概括。已经有大量而经典的聚合机制被发表，这里的五个经典的机制在表IV中被总结。除了其在淀粉样疾病发病中的作用外，蛋白质聚合经常对制造业和蛋白质治疗学的发展提出挑战。非自然聚合在近几年得到了广泛的关注，无论是生产业，学术界还是监管机构。首先，治疗蛋白质的聚合可能在治疗期间提高其免疫原性，这将增加病人的发病率和死亡率。第二，生物活性的分子结构因为聚合而被破坏，因此降低药物效价。最后，聚合蛋白能够使溶液浑浊或是物理的从溶液中分离，因此降低药用蛋白的品质并可能产生不能被专用的医疗卫生机构所接受的有毒成分。蛋白质聚集是一个术语，它可以包含多种类型的分子组装。聚合可以产生非共价键连接或共价键连接，它可以是在不同方面的广泛的可逆性。查明蛋白聚合原因的最大挑战是，蛋白聚合不是一个单一的原因造成的（表IV）。聚合可能有多种原因，如在蛋白表达中的非正确折叠，纯化过程中蛋白自然状态被打乱，组份，冻融，冻干，超滤/渗滤，小瓶和注射器灌装，抽水，运输或贮存。这些进程可能将蛋白质暴露于可能造成损害的条件下，如冷冻，脱水，极端pH值，气液界面，固液界面，或高或低的温度下，破坏产品的稳定性。尽管潜在原因和聚集途径具有多样性，目前的模式是，为了更好地控制加工和贮藏过程中蛋白质的聚集，重要的是要考虑的一种蛋白质内在构象稳定性以及蛋白质与蛋白之间的相互作用。大体来说，构想的稳定性被认为是控制聚合的最关键因素。这是因为蛋白分子的非自然聚合状态是从部分展开状态开始的；因此，瞬时的活性状态的等级，有时也被称为N *（由于其结构相似于自然状态），被认为是蛋白聚合过程中的限速因子。例如，人体生长荷尔蒙及酸性成纤维细胞生长因子的聚集已得到有效抑制通过添加保持其自然状态的热力学稳定剂。在这种情况下，稳定添加剂可以完美的和蛋白结合，从而降低溶液中聚合活性状态物质的浓度。另一个例子是，通过添加蔗糖来阻止重组人干扰素-的聚合，这可以提高其自然状态向聚合活性状态转变的热力学障碍（图4）。同样，变性剂，盐酸胍，降低了热力学障碍，导致聚合率增加。蔗糖的稳定作用是其优先的排斥机制，这个观点首先是被Timasheff和其同事提出的。在所有这些情况下，在溶液条件下的蛋白聚合的是被减少或抑制的，通过提高Gu值。 为了理解聚合的机制和更好的设计方法减少聚合形成，许多人测定聚合的动力学。关于这方面一些很好的概述文章为我们的阅读提供了优秀题材。困难在于，有些可能的动力学方案可以被设想。区别它们是很困难的，尽管一个计划目标被斯Morris等人提出，似乎适合一些文献中的数据集。事实上，在许多领域的主要研究人员认为，除非是精心制作的动力学研究被完成，这个研究几乎是不可能得出一个独特的机械的图表的。因此，预计该领域将继续发展，作为聚集需要了解的基本的分子细节是如此之多。沉淀反应粒子结构在1989年综述列出了沉淀作用是四种主要的物理不稳定途径之一。重要的是要说明什么是沉淀反应的意思。一方面，可溶性聚合形成可以持续到聚集物是如此大时，他们再也不能继续溶解。这个结果在宏观聚集现象我们能观察到朦胧或浑浊。通常，现在被称为粒子或微粒的结构。这种现象是不可逆转的，蛋白质被部分或完全展开。微粒结构已成为在蛋白质疗法的发展中重要的科学和调控焦点。 在注射产品有药典方法测量微粒，如美国药典的方法。但是，这种方法只关注10和25微米以上的颗粒。最近，subvisible颗粒受到了极大的关注，无论从管理机构以及该领域的研究人员。人们担心，这可能是在蛋白质产品中发现的微粒的最大免疫原性。此外，新的分析方法，如微血流显像（MFI），不仅可以使人在这个尺寸范围量化颗粒，但也捕捉到单个粒子的图像，从而能够从杂质中区分蛋白质聚集体。 另一方面，并不是所有的不溶性蛋白质都是由于聚集反应。盐分离蛋白，那就是，增加溶质的排除造成蛋白质的化学电位可能超过固相。虽然我们对蛋白质溶解度的认识仍然是不完善的，在过去20年取得重大进展。盐分离蛋白仍然保留活性和天然性状结构，沉淀是完全可逆的稀释。表面吸附作用 一种蛋白质在生物加工和最后剂型形成过程中可能接触无数表面，界面稳定是一个不可低估的重要因素。自身吸附是一种物理的不稳定，因为它改变了蛋白质的物理状态。然而，更成问题的是，可以在界面接触产生压力随后发生的损害。蛋白质在水溶液中吸附到已知的各种表面。例如，G - CSF，一个疏水细胞因子和IL- 2已被证明可吸附到玻璃上。对IgG1的结合塑料已被报道和牛血清白蛋白（BSA），像其他蛋白质，显示一些吸附不锈钢的特性。结果，许多生物物理在蛋白质的吸附研究已发表，特别是因为它适用于加工和蛋白质不稳定。 表面诱导蛋白质不稳定始于表面天然吸附或部分展开蛋白; 这种互动是通常更积极有利当一个蛋白局部展开由于他们更多的接触疏水氨基酸侧链，它们通常埋在蛋白质的核心区。经过初始吸附的蛋白质，在（即气液界面，固液界面）的不同界面的表面张力可以驱动通过影响蛋白质分子结构的完整性，填充界面区聚集。在表面与来自表面的部分展开蛋白质解吸相结合的结构摄动可能导致成核现象和聚集物的生成在总体溶液中。因此，蛋白质的界面稳定性被认为是一个关键因素，表面张力，可吸附表面积，蛋白质分子（即疏水性）的表面属性，结构稳定性。 在固体界面蛋白质遭受降解作用的一些类型的报告越来越多。这是特别真实的膜相互作用，蛋白质在其中进行膜聚集和污染。看来，这对在溶液中稳定的蛋白质抑制聚集的相同的方法将适用于膜的损伤作用。这包括提高构象的稳定性，降低蛋白质间相互作用的吸引力，并利用表面活性剂限制的蛋白质表面吸附。 此外，外国还有一些物理的蛋白质不稳定的主要原因的报告。例如，在PAFase纳米玻璃器皿开口管形瓶除热原期间导致聚集。在灌装过程中，金属粒子可以引进，形成细胞核聚集体形成。不锈钢纳米粒子也可引起聚集反应。多种过滤材料橡胶，玻璃