《dna重组》PPT课件.ppt

基因工程 郑州大学生物工程系 主讲教师：刘红涛 第二章 DNA重组 DNA重组的概念及意义 在自然界，生物体内时刻发生DNA的重组 ，呈现出对生物有利或有害的变异。这种重 组不受人们意志控制，重组结果难以预测。 基因工程涉及的DNA重组是根据人们的愿 望，进行严密的设计，在生物体外通过人为 的DNA片段化的重新连接，产生新的重组 DNA分子，使其遗传信息发生变化，达到 人们希望的目的。 2.1 DNA的组成和结构（略） 2.2 天然DNA的制备 2.2.1 天然DNA的来 源和用途 线粒体 和叶绿 体DNA 质粒DNA 病毒和 噬菌体 DNA 染色体 DNA 天然DNA 2.2.2 天然DNA的提取 准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA 1、准备生物材料 选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择 DNA得率最高的生长期。如: 大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。 植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗，减小淀粉对提取 DNA的干扰。 肝脏DNA：要清除胆囊，主要是去除多种高活性的酶 。 2、裂解细胞 这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量 的关键步骤。 原核细胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰冻， 超声波等方法； 结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后 研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核 的方法。 3 3 、分离和抽提、分离和抽提DNADNA 提取总DNA：在裂解液中加适量酚氯仿异戊醇或氯仿 异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉 淀DNA，再离心。 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌 体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体 ，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。 提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀 ，再调节PH至中性，质粒DNA复性后从沉淀物中释出。 除RNA：用RNase水解除RNA， 分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中 加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降 系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区） 2.2.2.1 大肠杆菌源质粒DNA的提取 碱裂解法*： 原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂 中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性， 相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当用钾离子 取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来 ，离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。 实验步骤 挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无 菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生 素的LB液体培养基中，于37剧烈振摇下培养 过夜。 将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4以 5000g离心5min（两次）。 吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀重悬于100l 溶液中，剧烈振荡。 加200l 溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管5次 ，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶 液接触。不要振荡！将离心管放置与冰上5min 。 加150l溶液，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20s ，使溶液 在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，之后将 管置于冰上5min。 4离心12000g，5min，上清上清转移至另一离心管中。 加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），振荡混匀。 4离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。 用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀， 于室温放置2min。 4离心12000g，5min。小心吸去上清夜，将离心管 倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管 壁的液滴除尽。 用1ml70乙醇溶液洗涤沉淀，4离心12000，5min ，弃去上清，在空气中使核酸沉淀干燥。 用50l含无DNA酶的胰RNA酶（20lg/ml）的TE重新 溶解核酸，振荡，贮存于-20。 试剂： （1）溶液：50mmol/l 葡萄糖 25mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/l EDTA-Na2 （pH8.0） 5mg/ml 溶菌酶（临用时加） （2）溶液（新鲜配制）： 200mmol/l NaOH 1% （W/V） SDS （3）溶液（100ml）： 5mol/lKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml （pH4.8） ddH2O 28.5ml 2.2.2.2 噬菌体DNA的提取 溶源周期 溶菌周期 提取DNA的原理： 先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导过热诱导 ，使DNA从宿 主染色体DNA上释释放出来，再经过经过 溶菌周期培养，获获得大 量噬菌体，从中提取线线形的DNA。 提取过过程： 溶源菌诱导诱导 培养 分离噬菌体 DNA的提取 2.2.2.3 氯化铯法制备植物基因组DNA 材料准备 细胞裂解 DNA分离抽取 2.2.3 DNA的纯化 2.2.3.1 氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法 2.2.3.2 离子交换层析法 用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA 用羟基磷灰石纯化DNA 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 2.2.3.4 “基因纯”试剂纯化 2.2.3.5 从DNA样品中去掉EB 正丁醇（或异戊醇）抽提法 Dowex树脂层析法 2.2.4 DNA的浓缩 乙醇沉淀法 含一价阳离子的DNA溶液2体积无水乙醇沉淀 DNA离心溶于适量TE缓冲液或无菌水。 条件：-20，30 min以上；小于1kb或量较少时， 于 - 70沉淀，或延长时间。 正丁醇抽提法 DNA溶液 1体积正丁醇混匀离心（1600 r/min 1min）弃上清重复至所需体积用水饱 和乙醚抽提DNA溶液两次（除正丁醇）空气中蒸 发乙醚。 聚乙二醇浓缩法 DNA溶液透析袋置高浓聚乙二醇溶液 4浓 缩至所需体积。 2.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化 2.3.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 定义 是一类能识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使 每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 。 类型 型限制酶 型限制酶 型限制酶 EcoRI ：GAATTC CTTAAG （1）型限制酶（无用） 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM(即S-腺苷甲硫氨酸)。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧数千碱基 处随机切割DNA分子）。 （2）型限制酶（十分有用） 分子量：2万10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：有较为专一的识别位点。 （3）型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点3端约25bp处切 割DNA分子）。 限制酶的命名 型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列； 6个（大多数）：如EcoR 5-GAATTC-3 识别序列 6个：如Not 5-GCGGCCGC-3（8个） 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：Sau3A识别 ： GATC BamH识别 ： GGATCC 有的限制酶识别多种核苷酸序列。 如：Hind识别 4种核苷酸序列： 5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基C或T；Pu 嘌呤碱基A或G ） 2、各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构； 类限制酶识别序列特点 回文结构(palindrome) GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG 5 35 3 限制酶：BamH 正读与反读都相同。 以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。 为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。 3、各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成 各种粘性末端或平整末端； （1）粘性末端和平整末端 (a)5P单链延伸的粘性末端 (b)3OH单链延伸的粘性末端 粘性末端（粘端） G AATTC CTTAA G GAATTC CTTAAG 如：Eco R 5 3 5 3 5 35 3 CTGCA G G ACGTC CTGCAG GACGTC 如：Pst 5 3 5 35 3 5 3 平头末端（平端） CCC GGG GGG CCC CCCGGG GGGCCC 如：Smal 5 3 5 35 3 5 3 （2）两种特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶 同尾酶（isocaudamer） 有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶序列也各不相 同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为 同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。 Bam Bam HHBglBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类 酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bst （a）切点位置相同 CCCGGG GGGCCC C GGGCC CCGGG C + Xma CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + Sma （b）切点位置不相同 4、某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的 识别序列特异性发生改变。 限制酶的第二活性：在甘油浓度、离子强度、pH值、 有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独 或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发 生改变，在DNA内产生附加切割，称为限制酶的第二 活性，又称Star活性。能产生第二活性的酶常在酶名称 的右上角加一星号“”，如EcoR 。 2.3.5 限制性核酸内切酶反应系统 反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的 反应温度等。 2.3.5.1 底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子 构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化 等密切相关。 DNA纯度； DNA分子构型； 识别序列侧面的序列(保护碱基，如 EcoRI,GAATTC)； 位点偏爱； DNA甲基化。 2.3.5.2 限制性核酸内切酶用量 主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反 应条件下，60 min内完全切割 1g DNA所需的酶活 性。 酶活性高的用量少，反之则多。 能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。 等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量 多，反之则少。 2.3.5.3 限制性核酸内切酶反应缓冲液 包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏 糖醇(DTT)或-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac 。 2.3.5.4 限制性核酸内切酶反应温度 大多数的最适反应温度是37，而少数酶的最适反 应温度高于或低于37。 2.3.6 限制性核酸内切酶的Star活性（见前） 几乎所有的限制酶都具有Star活性。 Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA 片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一 步的DNA连接重组。 排除方法：如降低反应系统中甘油含量，控制pH 中性和高盐浓度下进行反应。 2.3.7 DNA分子片段化 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的 DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单 酶切、双酶切和部分酶切等方法。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上 的全部识别序列进行不完全的切割。 EcoRIEcoRIEcoRI EcoRI 1234 2.3.8 DNA分子的限制性图谱 2.4 特异性DNA片段的PCR扩增 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ） 即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年发明，又 称基因的体外扩增法。也有人称无细胞分子克隆法。 PCR技术的用途 目的基因的扩增与分离； 医疗诊断； 基因突变与检测； 分子进化研究； 环境检测； 法医鉴定。 1 PCR的基本原理 一、基本原理 变性 95C 延伸 72C 退火 Tm-5C Tm=4(G+C)+2(A+T) 9095 301 3760 301 7075 302 预变性5min 目的（1）破坏DNA中可能存在的较难 破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减 少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于 引物更好的和模板结合，特别是对于基 因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这 个步骤。 （2）此外，在一些使用热启 动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从 而使PCR反应得以顺利进行。 二、“长产物片段”和“短产物片段” “短产物片段”是严格地限定在两个引物链5端 之间的，正是需要扩增的特定片段；“长产物片 段”则带有不需要的“尾巴”。 “短产物片段”是按指数倍数增加的；而“长产物 片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。 三、平台效应 在PCR反应中，当引物模板与DNA聚合酶达 到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱 和，会出现“平台效应”，即PCR反应产物不再 增加。 平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷 贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP 的浓度等多种因素。 2 PCR反应条件的优化 一、标准PCR反应流程 （一）反应体系 标准PCR反应体系为50100l ，其中包含： 1PCR反应缓冲液 4种dNTP：各200M 两种引物：各0.25M DNA模板：0.1g Taq DNA聚合酶：2U （二）反应步骤 二、PCR反应条件的优化 特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率 的三个指标。 PCR反应的主要影响因素有： （一）循环参数（反应温度与时间） 变性 退火 延伸 循环次数 （二）PCR反应成份 Taq DNA聚合酶 引物 dNTP 缓冲液 模板 其它因素 高温启动 添加剂 3 引物的设计 一、设计原则 PCR扩增引物：是指与待扩增DNA区域两端序列 互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常 在1530个核苷酸之间。它包括引物1和引物2。 引物1：又称Watson引物，是5端与正义链互补的寡 核苷酸，用于扩增编码链或mRNA链。 引物2：又称Crick引物，是3端与反义链互补的寡核苷 酸，用于扩增DNA模板链或反密码链。 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率 和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。具体 的设计原则见书P57。 二、引物长度 引物太短可能同非靶序列杂交，得出非预期 的扩增产物。 引物过长引物同模板DNA的杂交速率下降， 结果在反应循环周期内无法完成同模板DNA的 完全杂交，从而减低PCR反应的效率。 三、引物的5端修饰法 5端附加核酸序列（加酶切位点等） 功能基团修饰法 放射性核素（修饰三磷酸） 非放射性分子（修饰碱基，如用Dig, Biotin等） 4 耐热DNA聚合酶 一、Taq DNA聚合酶 热稳定性 无3 5外切酶活性 反转录活性 非模板依赖的聚合活性 影响酶活性的因素 二、其它耐热DNA聚合酶（见书P56） Pwo DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 C. therm.聚合酶 vent DNA聚合酶* Pfu DNA聚合酶* 2.5 DNA片段的化学合成 2.5.1 寡核苷酸片段的化学合成的方法 磷酸二脂法 磷酸三脂法 固相亚磷酸三脂法（常用） 见60-66页 2.5.2 化学方法合成的DNA片段 化学方法可合成DNA互补链的引物、寡核 苷酸连杆以及基因片段和元件等。 合成DNA互补链的引物 除PCR引物外，还有测序引物。见下表。 DNA寡核苷酸连杆（linker） linker：是指用化学方法合成的一段由1020个核苷 酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端 的双链寡核苷酸片段。 linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与另 一有相同粘末端的DNA片段连接。（附图） 化学合成的寡核苷酸中，有的含有一个反向重复序 列而形成一个双链发夹结构。在双链部分有一种限 制性核酸内切酶的识别序列，切割后产生一定的粘 末端或平末端。这种寡核苷酸可兼作连杆和引物， 即测序引物连杆。 由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别 序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克 隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点寡核苷酸 连杆或简称MCS连杆。 （附图） 衔接头（adaptor） adaptor：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶 粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短 片段。（附图） DNA芯片 DNA芯片：是DNA片段以预先设计的排列方式固定 在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列。 2.6 DNA片段大小的凝胶电泳检测 方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 、琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲场凝胶电 泳等方法。 条件：中性或偏碱性的缓冲系统，DNA带负电 。 运动方向：DNA经过凝胶分子筛移向正极。 迁移率影响因素：DNA分子的大小和构型，与 DNA碱基组成和顺序无关。 检测：溴化乙锭染色，紫外光下发红色荧光。 2.6.1 琼脂糖凝胶电泳参数 凝胶缓冲液和电泳缓冲液 常用：TAE（使用广泛，缓冲容量小）、TBE(缓冲能力强，长 时间电泳)、TPE（缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉 淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用 ） 凝胶中琼脂糖含量 检测大片段DNA的含量小，反之则大。 加DNA样品 一般1g以下，多了会使大小接近的DNA带不易分开，少了会 影响小片段DNA带的检测。 电泳条件 注意：靠加样孔一侧为负极。 电压：110V/cm（依据分辨力要求、DNA片段大小和电泳时 间决定） 溴化乙锭（EB）染色和紫外观察 注意：溴化乙锭是很强的诱变剂，操作时应带手套！溴化乙锭 溶液必须经处理后才能废弃。 2.6.2 DNA片段（分子）大小的估算 将待测DNA片段直接与Marker比较； 通过Marker的相对迁移距离，推测出待测DNA 片段的大小。 M CK 1 2 3 4 5 6 bp 2000 1000 750 500 250 100 2.6.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数 制胶的电泳缓冲液： 90nM Tris-硼酸缓冲液 凝胶丙烯酰胺含量：按表2-24进行 加DNA样品：加样孔一端为上方。上下电泳槽加入电 泳缓冲液，凝胶要完全接触电泳缓冲液，接触处不得有 气泡。 电泳条件：缓冲液槽在上方为负极，下方为正极，电压 5V/cm，室温。 EB染色和DNA片段大小估算（同琼脂糖凝胶电泳） 2.6.4 脉冲场凝胶电泳（ CHFE）参数 缓冲液： TBE或0.5TBE，蠕动 泵驱动循环。 凝胶：用0.5%TBE制备的琼脂糖 凝胶按图2-16装入电泳槽，加入电 极缓冲液，超过凝胶23。 加入DNA样品 电泳条件：交替改变的电场力， 由编程转换装置控制脉冲参数。 DNA的EB染色 DNA片段大小（分子）的估 算：可检测几百万bp的DNA片段 。脉冲场凝胶电泳分离片段大小及 迁移速度的经验公式见表2-25。 2.7 DNA片段的连接重组 2.7.1 DNA连接酶（DNA Ligase） DNA连接酶：是在1967年发现的一种能够催化 双链DNA片段紧靠在一起的3羟基端与5磷酸 基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接 起来的酶。 如果是两个或两个以上不同的双链DNA片段末 端连接，则产生重组DNA分子。 连接酶的主要类型： E. coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 DNA连接酶连接作用的特点 DNA连接酶需要一条DNA链的3末端有一个游离 的羟基（OH），另一条DNA链的5末端有一个 磷酸基（P）的情况下，才能发挥连接DNA分子的 作用。 只有当3OH和5P彼此相邻，并且各自位于与 互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时 ，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。 DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的 单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA 分子的一部分。 DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二 酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链 DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的 单链裂口（gap）。 由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种 吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时， 还需要提供一种能源分子（NAD或ATP）。 2.7.1.1 E. coli DNA连接酶 E. coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性 末端之间的连接，不能催化双链DNA平末端之间的 连接。 2.7.1.2