毕业设计（论文）-蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测.doc

哈尔滨学院本科毕业论文（设计）哈尔滨学院本科毕业论文（设计）题目：蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测院（系）理学院专 业化学年 级2007级姓 名xxx学 号07052108指导教师xxx职 称副教授2011年 6月 13 日目 录摘 要1abstract2前 言4第一章实验部分61.1 仪器与试剂61.1.1仪器61.1.2试剂6 1.2 实验原理61.3 实验过程71.3.1溶液的配置71.3.2两点法残留农药速测71.3.3数据处理和计算公式8第二章 结果与讨论102.1 实验影响因素102.2 实验结果讨论102.2.1酶抑制剂法的优缺点102.2.2酶抑制剂法使用过程中应注意的几个问题102.3 分光光度法112.3.1实验步骤112.3.2结果计算112.3.3实验结果分析122.3.4检测注意事项122.3.5分光光度法存在的问题探讨122.4 两种方法的讨论13第三章 结论14参考文献15致 谢16i摘 要随着环保意识和健康意识的加强，农药残留危害性越来越受到重视。许多国家制订了食品中农药残留限量，加强了关键检测技术的研究和应用。传统的检测技术如气相色谱技术由于检测成本高、检测时间长、不能对蔬菜进行有效的产前、产中、产后监督管理。为了有效地快速监督管理农药残留的直接危害，农药残留快速检测技术非常重要1。近几年，在各个领域展开了农药残留快速检测技术研究，快速检测技术突飞猛进。目前研究和应用较多的快速检测技术主要有活体检测法、化学检测法、酶抑制法、免疫分析法、仪器分析法等2。中国的农产品农药残留检测尚处于起步阶段，检测方法标准的制定工作还滞后于农产品市场发展的需要。今后应加快检测标准的制定，尽快研究出适合中国国情的多残留检测方法，加强技术培训，并以较低的成本普及到生产和销售领域中去，为提高农产品质量做出应有的贡献。本文研究的是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小3。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。关键词：有机磷；氨基甲酸酯；分光光度法；酶抑制剂abstractwith the enhancement of environmental protection consciousness and health consciousness, pesticide residue harmfulness has attracted the attention of people . many countries have drawn up the pesticide residue limit in food and have strengthened the research and application of key measurement technique. traditional measurement technique such as gas chromatography technology cant give supervision and management to vegetable effectively before, during or after production because of high cost and long test time. in order to supervise and manage the immediate harm of pesticide residues effectively, rapid measurement technique of pesticide residue is very important 1. in recent years, the research of rapid measurement technique of pesticide residue was developed in all areas ,and rapid measurement technique was improved by leaps and bounds. at present ,main rapid measurement techniques include in vivo detection method, chemical detection method, enzyme inhibition method, immune analysis method and instrument analysis 2. the detection of chinas agricultural products pesticide residue is in initial stage and the establishiment of detection method standard still lags behind the needs of the development of the agricultural product market. we should speed up the establishiment of detection standard , and excogitate detection method suitable for chinas national conditions, strengthening residue and popularize detection method to areas of production and sales at lower cost ,in order to improve the quality of agricultural products to make due contributions. in this paper, according to the principle that organophosphor and carbamate pesticide can restrain the activity of acetylcholine esterase, such biochemical reactions substrates as iodinated acetyl sulfur choline and acetylcholine esterase were added to abstraction solution of vegetables, if vegetables didnt contain organophosphor and carbamate pesticide residues or low residual, the enzyme activity would not be restrained, the substrate in experiment could be hydrolyzed by the enzyme, hydrolysate and chromogenic agent produced yellow substance.if the abstraction solution of vegetables contained high pesticide residues, the activity of enzymes was restrained, substrate would not be hydrolyzed, the solution didnt show color or color change was very little, when chromogenic agent was added 3. using spectrophotometer in 412 nm place or rapid detecting instrument of pesticides, absorption values were measured.according to the calculated inhibition rate, we could judge the residual amount of organophosphor and carbamate pesticide in vegetables .keywords: organophosphor；carbamic acid ester; spectrophotometric method; enzyme inhibito前 言目前农药残留的化学快速检测技术研究主要是根据有机磷农药的氧化还原特性。 有机磷农药磷酸酯、二硫代酸酯、磷酰胺在金属催化剂作用下水解为磷酸与醇,水解产物与检测液反应使检测液的紫红色褪去变成无色。本方法的特点是避免了使用酶的不稳定、不易保存，但该方法局限于有机磷灵敏度不高、易受一些还原性物质干扰3。酶抑制技术在农药残留检测技术方面的研究进展中。酶抑制技术是研究比较成熟、应用最广泛快速的农药残留检测技术；是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的特异性生化反应建立起来的农药残留的微量和痕量快速检测技术2。国内外近几年对选用酶的种类、底物和检测方法做了大量的研究。碘代硫化乙酰胆碱为底物，二硫代二硝基苯甲酸和碳酸氢钠为显色剂，根据颜色的变化测定酶的活性。有机磷农药和氨基甲酸酯类农药抑制了的活性， 引起碘代硫化乙酰胆碱不能水解，造成积累，利用碘代硫化乙酰胆碱与二硫代二硝基苯甲酸反应生成黄色的巯基硝基苯甲酸。从而测定其吸光度即抑制率确定酶的活性根据酶的活性估算农药残留量4。目前国内大多农药速测仪都是利用颜色的变化“吸光度原理研究设计”的。如福建省测试技术研究所研制出便携式农药残留速测仪用于农药残留的检测；农业部农药检定所设计的农药速测仪；厦门欧达科仪公司生产的速测仪；上海光电技术研究所设计的农药残留仪等1。不同公司研制的仪器大同小异，只是在酶和底物应用方面存在细微的区别，从而判定的抑制率也存在差异5。农业部农药检定所选用的是丁酰胆碱酯酶；上海光电技术研究所和厦门欧达科仪公司等选用乙酰胆碱酯酶。氯化乙酰胆碱在胆碱酯酶作用下产生酸根据颜色的变化测定酶的活性6。当有机磷农药和氨基甲酸酯类农药存在时酶的活性受到抑制，氯化乙酰胆碱在胆碱酯酶作用下产生的乙酸量也相应减少，影响吸光度值，通过测定吸光度的变化测定乙酰胆碱酯酶受抑制的程度，从而检测出蔬菜中农药残留量3。植物酯酶水解二氯乙酰锭酚，根据反应溶液反应前后颜色的变化测定酶的活性，酶可以催化二氯乙酰锭酚分解产生兰色靛酚。当有机磷农药存在时，抑制了酶的活性导致样品溶液呈浅兰色或橙色不变7。根据与对照溶液比较确定样品中是否含有有机磷农药。浙江、广州、深圳等地研制出乙酰胆碱酯酶速测卡、速测箱用于定性检测大多是根据酶催化二氯乙酰锭酚产生兰色靛酚的量进行比色确定抑制率1。其它的技术还有如乙酰萘酯为底物的等原理的速测技术。酶制技术检测农药残留操作简便、快速、灵敏、经济、样品无需净化，但是此方法不能定性定量，在检测韭菜、生姜、葱、蒜、香菜、胡萝卜、辣椒、西红柿等蔬菜容易受到干扰，只能作为有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的初筛8。随着研究的深入，酶抑制技术检测农药残留在检测方法上也有较大的突破。除检测时间在市场应用前景广阔；免疫分析技术在农药残留快速检测方面的进展；免疫分析技术应用于农药残留检测技术方面的有放射免疫分析和酶免疫分析。目前酶免疫分析技术尤其是酶联免疫分析在农药残留检测中的应用研究在国外非常活跃，应用也日趋普遍，酶免疫技术分析主要是基于抗原和抗体特异性识别和结合反应的分析方法。大分子量的农药可以直接作为抗原免疫动物产生抗体，小分子量的农药属于半抗原， 一般不具有免疫原性不能直接免疫动物产生抗体，因而小分子量的农药一般要与分子量大的载体偶联制备人工抗原以检测技术9,10。本文采用酶抑制剂法进行蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。因此有两种仪器可供选择，常用的仪器是分光光度计，另一种为食品安全快速检测仪。由于本实验侧重的是快速，所以主要采取食品安全速测仪，采取两点法残留农药速测。国内目前非常流行的残留农药速测方法，通过测定3分钟前后的对照和样品溶液吸光度变化值计算抑制率。但本文中也会对分光光度仪的检测方法进行介绍。本文试验中样本为食堂中学生常吃的麻辣烫中所用蔬菜中的五种，看看我们身边的蔬菜是不是可以放心的食用。第一章 实验部分1.1 仪器与试剂1.1.1仪器仪器名称仪器名称0.75生产厂家1.5optizen 2120v-f 食品安全快速检测仪韩国美卡希斯公司uv-2550 分光光度仪日本岛津公司 1.1.2试剂试剂名称等级成产厂家无水磷酸氢二钾分析纯北京红星化工厂磷酸二氢钠分析纯天津石英钟长霸州市化工分厂碳酸氢钠化学纯北京化工厂乙酰胆碱酯酶化学纯韩国美卡希斯公司碘化乙酰硫代胆碱化学纯韩国美卡希斯公司二硫代二硝基苯甲酸化学纯韩国美卡希斯公司1.2 实验原理根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。1.3 实验装置与过程1.3.1溶液的配制(1) ph8.0缓冲液 分别称取2.975g无水磷酸氢二钾与0.8g磷酸二氢钾，溶解于250 ml蒸馏水中。(2) 乙酰胆碱酯酶（实验专用酶） 根据酶活力用缓冲溶液溶解，3 min的吸光值变化a0值应控制在0.3以上。摇匀后在05冰箱中保存，保存期不超过4天。(3) 底物碘化乙酰硫代胆碱 称取25.0 mg碘化乙酰硫代胆碱，用3.0 ml缓冲溶液溶解，在05下保存。保存期不超过2周。(4) 显色剂 分别称取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氢钠，用20 ml缓冲溶液溶解，4冰箱保存。1.3.2两点法残留农药速测本实验所用仪器有三种检测农药残留的方法，分别为终点法、两点法和动力学法。终点法是酶抑制剂初期常用的方法，两点法是现在国内常用方法，动力学法是国外常用方法。所以本实验采用两点法。(1) 样品处理选取有代表性的蔬菜样品5种，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 ml缓冲液，振荡12 min，倒出提取液，静置3-5 min，待用。(2) 空白溶液 先于小烧杯中加入2.5 ml缓冲液，再加入0.1 ml显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值。(3) 对照溶液 先于试管中加入2.5 ml缓冲液，再加入0.1 ml酶液、0.1 ml显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上。加入0.1 ml低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值a0。 (4) 样品溶液先于试管中加入2.5 ml样品提取液，再加入0.1 ml酶液、0.1 ml显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上。加入0.1 ml低物摇匀，立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值。1.3.3 数据处理和计算公式(1) 蔬菜样品编号23456样品菠菜大头菜白菜生菜油菜 (2) 数据两点法 ctrl a1=0.013 a2=0.014noc#abs1abs2absinhibpass122.1422.1430.0010.010230.1150.1140.0010.000340.9390.9300.0090.000450.4170.4200.0030.000561.6831.6650.0180.000（pass为0表示农好药残留量合格不过量，为表示农药残留量不合格过量。）(3) 计算公式abs（对照）= abs（3分钟后对照） abs（3分钟前对照）abs（样品）= abs（3分钟后样品） abs（3分钟前样品）抑制率 = abs（对照） abs（样品）abs（对照） 100(4) 部分农药残留限量标准 (表1 农药浓度与抑制率对照表)甲胺磷浓度(g/ml)0.40.81.6抑制率35.052.069.0氧乐果浓度(g/ml)0.40.60.81.21.63.75抑制率26.429.436.752.759.676.3敌百虫浓度(g/ml)0.10.150.20.250.40.5抑制率13.622.937.250.663.973.9呋喃丹浓度(g/ml)0.0010.0020.0030.0040.0060.008抑制率25.250.358.866.873.278.9(表2 国内外农药残留量最高限量标准)有机磷与氨基甲酸酯类农药甲胺磷氧乐果甲萘威敌百虫who/fao的规定每日每公斤体重允许摄入量(adi)ug/kgbw40.31010epa规定每日每公斤参照摄入量(rfd) mgkg0.055毒性(雄性大鼠经口ld50)mgkg203050814560国外每人每天实际摄入量ug /60kg0.9360.33750.006国内每人每天实际摄入量ug /60kg23.92.9fao 规定蔬菜农药残留量允许限量(mrl)mgkg0.510.50.1国内规定蔬菜农药残留量允许限量(mrl)mgkg(中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会 发布) 第二章 结果与讨论2.1 实验影响因素本实验采取的是两点法残留农药速测，实验结果五个样品均达标。蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制法最关键的影响因素是酶。当温度条件低于37 ，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3 min的吸光度变化abs值在03以上，然后往下操作。试样放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3 min的吸光度变化abs 值03的原因，一是酶的活性不够，二是温度太低。当试样溶液的吸光度大到无法读取时，说明测定液浑浊，应改变提取条件排除干扰后测定。2.2 实验结果讨论2.2.1酶抑制剂法的优缺点：(1) 优点：在于简单方便，快捷、成本低廉。整个检测过程只需30分钟左右，它可以作为传统仪器分析方法的有益补充，针对市场、农场蔬菜农药残留量进行快速筛选监测，保证上市蔬菜食用的相对安全性。 (2) 缺点：酶试剂易失活，导致反应不稳定，检测结果误差较大，重复性不好，实际应用中的确认率大约为60%70%左右；存在检测盲区，只能检测有机磷和氨基甲酸酯两类农药，不能检测有机氯类、菊酯和其它类别的剧毒农药；不适合检测葱蒜类、香菜、韭菜、番茄、胡萝卜、茭白、蘑菇、花椒等14种容易出现假阳性的农产品；需要对检测人员进行专门培训，否则将会对出现的问题无法正确处理或判断，得出错误的结果。2.2.2酶抑制剂法使用过程中应注意的几个问题 (1) 检测室温度在2030之间时，使用改进后的酶，此时不用放在3738的保温箱中培养，可以直接在室温下培养，22左右培养20分钟，25以上培养15分钟，一旦室温低于20，必须进3738保温箱培养。 (2) 样品处理时，加入提取试剂混合后不用倒出上层清液，直接在原器皿中静置3-5分钟。(3) 配置检测液时，用圆底小试管代替仪器配置的平底小试管，方便在样本混合器上混合。 (4) 于待测液中加入底物混合后，要快速转移到比色杯中进行比色，否则容易影响检测结果。(5) 速测仪法是使用分光光度计测定待测液吸光值随时间的变化而计算检测结果的，因此保持比色杯的清洁也是一个减少检测误差的环节。经摸索，我们发现用热水浸泡和用洗衣粉清洗比色杯比较容易洗干净。2.3 分光光度法 分光光度仪与食品安全快速测仪检测蔬菜中农药残留的操作基本相同，实验原理与溶液配制基本相同，实验步骤和计算公式稍有不同。由于分光光度法是以往常用的检测手段所以在这里就不进行从实验了，仅列出此种方法进行简单的介绍和与速测仪进行比较。2.3.1实验步骤 (1) 样品处理 选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 ml缓冲液，振荡12 min，倒出提取液，静置35 min，待用。 (2) 对照溶液测试 先于试管中加入2.5 ml缓冲液，再加入0.1 ml酶液、0.1 ml显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 ml低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值a0。 (3) 样品溶液测定先于试管中加入2.5 ml样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值at。2.3.2结果计算 抑制率（%）= 式中 a0对照液反应3 min吸光度的变化值； at样品溶液反应3 min吸光度的变化值。(表3 酶抑制率法对部分农药的检出限 mgkg)农药名称检出限农药名称检出限敌敌畏0.01氧化乐果0.4对硫磷1.0甲基异柳磷5.0辛硫磷0.3灭多威0.1甲胺磷0.6丁硫克百威0.05马拉硫磷3.0敌百虫0.2乐果3.0呋喃丹0.052.3.3实验结果分析当蔬菜样品提取液对酶的抑制率大于50% 时，表示样品中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果，对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。药残检测结果根据酶抑制率的药残检测数值，进一步判断抽检的蔬菜样品是否合格。大于或等于70%10视为不合格蔬菜（至少重复两次）。2.3.4检测注意事项(1) 对照组必须在a组中测出结果。并以此作为参考值。(2) 化学试剂配制无比精确，应在7天内用完试剂，以保证其准确性。(3) 在操作过程中，要按对照、样品1、2、3、4的顺序。依次进行酶显示剂和底物的添加。若顺序颠倒，则检测结果不够准确。(4) 比色皿用后用蒸馏水彻底清洗干净，以免影响透光率。(5) 酶液不要用干净，因为底液的活性会明显降低。2.3.5分光光度法存在问题的探讨(1) 假阳性的产生不同植物的组织液、次生物质、叶绿体、花青素等能与底物或显色剂其反应，蛋白质、氨基酸、电解质等生物化质也会干扰影响酶反应，也能改变光波的吸光度、透光率，影响测定结果。(2) 抑制率出现负值结果中抑制率偶尔出现负值，这是指在计算中样本的吸光度变化值比空白的吸光度变化值要大。造成这一现象的原因：一是操作中的系统错误，从吸光值变化动态曲线可以看出，酶分解底物、分解物在与显色剂结合，这样的动力学过程尽心的是非常快的，如果操作中不够熟练就会产生人为的系统误差。另外，同一种蔬菜，由于不同次重复提取时所取蔬菜样本的部位不同，这种较小的负值误差（10%以下）是在允许范围之内，可以认为这种情况下的样本中无农药检出。2.4 两种方法的讨论 分光光度计与食品安全速测仪(以下简称速测仪)同样是利用酶抑制剂原理进行测定蔬菜中农药含量。但分光光度计测定的是绝对值而速测仪测定的是相对值。分光光度计是实验室中相对常用的仪器而速测仪适合野外作业。分光光度计的检测速度慢，速测仪顾名思义检测速度快，是专门针对野外作业而设计的检测仪器。第三章 结 论 本实验选取的五个样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量均已达标。多年来，蔬菜中农药残留超标问题一直较突出，原因之一是现在标准施行的农药残留测定需要通过有机溶剂提取、净化和用大型分析仪器进行。无法对廉价的蔬菜进行随时随地的快速检测。为解决这一问题，我们对使用范围广、用量大的有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测方法进行了研究，建立了这种规范检验方法，不受时间、地点、场合等条件限制，从样品处理到得出结果l530 min内完成，如果附加恒温装置，一次可完成多个样品。酶抑制率法的检出限与抑制率由于酶源的不同，检出限(最低检出浓度)与抑制率往往不同。丁酰胆碱酯酶的抑制率一般控制在70 以上为阳性样品。乙酰胆碱酯酶的抑制率一般控制在50以上为阳性样品。衡量的标准应该用检出限与符合率来判断，即检出限不能太高，太高容易使一些农药超标的蔬菜检测不出来，太低容易出现假阳性。附录(表1)列出了用乙酰胆碱酯酶试验得出的部分农药的检出限和抑制率。这种方法的建立，可在监督环节发挥作用，有利于及时发现问题、采取措施，控制高残留农药蔬菜的摄人，降低农药中毒发生率，保障消费者食菜安全。参考文献1 李艳霞, 张保东. 农药残留检测技术的研究j. 周口师范学院学报,2005, 22(5): 79-82.2 holger s, sandra v, francois v, et al. design ofacetylcholinesterases for biosensor applicationsj. biosensors andbioelectronics, 2003, 18: 201-209.3 larosa c, pariente f, hernanddez l, et al. amperometricflowthroughbiosensor for the determination of pesticidesj. anal chimacta, 1995, 308: 129-136.4 陆贻通, 周培, 李振红. 生物酶技术在农药残留快速检测中的应用进展j. 上海环境科学, 2001, 20(10): 467-473.5 张宁. 果蔬中有机磷农药残留快速检测方法研究j. 安徽农业科学,2005, 33(8): 1471-1472.6 孟范平, 唐学玺, 李桂芳. 利用乙酞胆碱酯酶传感器监测海水久效磷j. 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