岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞信号通路介导的凋亡的影响.doc

文章来源 毕业论文网 岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞信号通路介导的凋亡的影响文章来源 毕业论文网 1 引 言卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，化学药物治疗仍是术后治疗的主要手段，虽然以铂类为主的联合化疗提高了卵巢癌患者的总体反应率，但随之而来的肿瘤细胞的耐药成为困扰临床治疗的主要障碍。因此了解卵巢癌细胞的发生、发展及耐药机制，有助于探索对卵巢癌治疗的新靶点，提高卵巢癌的生存率。lewis y 抗原是双岩藻糖基化的寡糖，可能参与许多细胞功能，包括粘附、识别和信号转导等，有利于肿瘤的侵袭和播散。 75%的上皮性卵巢癌出现lewis y 不同程度的过量表达，且表达增加的患者预后不佳。我们利用建立的α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-ft) 基因及lewis y 稳定高表达细胞模型，研究发现lewis y 表达增加的同时，细胞的增殖、黏附等恶性生物学行为增强，对5-fu、卡铂、紫杉醇等多种化疗药物的耐药性也明显增强，凋亡率明显下降。 lewis y 抗体可以抑制上述变化。klinger 等研究发现抗lewis y 抗体ign311 和abl364 能抑制egf 受体介导的信号转导通路，抑制ras 的激活和mapk 的磷酸化，促进肿瘤细胞的凋亡，表明lewis y 与mapk 信号转导通路家族的相关性，因此，我们推测lewis y 可能通过p38mapk 信号转导通路影响细胞的生存与凋亡，进而导致卵巢癌细胞的耐药。本文探讨lewis y 抗原与p38 丝裂原活化的蛋白激酶(p38mitogen-actived protein kinase，p38mapk)信号途径的关系，探讨lewis y 抗原致卵巢癌耐药的机制，为进一步阐明卵巢癌的耐药机制提供理论依据，为卵巢癌的临床治疗提供新的方法和途径。2 材料2。1 卵巢癌细胞株细胞株rmg-i 源于卵巢透明细胞癌组织，rmg-i-h 细胞株为1,2-ft 及lewis y 抗原高表达细胞系，由本实验室建立，方法如下：利用pcr 的方法克隆人1,2-ft 基因的编码区hfut-h，构建表达载pcdna3。1-hfut-h，利用磷酸钙法将其转染入卵巢癌细胞系rmg-i，利用g418 筛选单克隆细胞，建立1,2-ft 基因稳定高表达细胞株rmg-i-h。2。2 主要试剂dmem 和胎牛血清为美国hyclone 公司产品；胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠(edta)为美国amresco 公司产品；二甲基亚砜(dmso)购自美国sigma 公司；annexin -fitc 试剂盒为晶美生物工程有限公司产品；p-p38mapk(phosph-p38mapk)、p38mapk 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specfic protease, caspase-3)抗体均购自美国santa cruz 公司；抗lewis y 单克隆抗体(clone a70-c/c8)购于英国abcam 公司，在细胞培养液中的终浓度是10ug/ml，无交叉反应，该抗体适合做免疫组化。p38mapk 特异性抑制剂sb203580 购自英国promage 公司；rt-pcr 试剂购自日本takara 公司。ecl 发光试剂盒购自美国pierce公司。2。3 主要仪器流式细胞仪facscalibur 为美国becton dickinson 公司产品；倒置荧光显微镜ix71 为日本olympus 公司产品；pcr 仪为日本takara 公司产品。3 方法3。1 细胞培养及制备细胞在含10%胎牛血清dmem培养液中培养，0。25%胰蛋白酶及0。02%edta消化传代，取指数生长期细胞用于实验。3。2 荧光染色法取指数生长期细胞，接种于6 孔板，接种浓度保证细胞在同一时间生长至约占底面积1/3，行同步化处理。p38mapk 抗体终浓度为2 ug/ml，p-p38mapk 抗体终浓度为4 ug/ml，二抗浓度均为2 ug/m l，另设阴性对照组。弃上清，每孔加入4%多聚甲醛300 μl 室温20 min后加入封闭用羊血清工作液100 μl，37 封闭30 min，加一抗50 μl 4 过夜，避光加二抗30 μl，荧光倒置显微镜(×400)观察并照相。3。3 rt-pcr 法分别提取细胞总rna，紫外分光光度计测定rna 的纯度和浓度，rt-pcr 操作按照rt-pcr试剂盒说明书进行。pcr扩增条件见table1。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。紫外灯下观察并拍照，每个样本重复3 次。3。4 western blot 法取指数生长期细胞，加0。5 ml/瓶细胞裂解液，上清液用bca 法测定蛋白浓度。准确吸取不同转染细胞的样品各50 μg，加载至sds-page 凝胶上电泳，然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质通过电转移印迹到nc 膜上，80 v 转移50 min。用5%牛血清白蛋白封闭nc 膜1 h，加1: 2000 稀释的抗p38mapk、p-p38mapk、caspase-3 抗体，室温3 h，然后用1: 8000 稀释的hrp 标记的山羊抗兔或山羊抗鼠igg 二抗室温3 h。ecl 试剂显色：等比例混合ecl 试剂盒中的a 液、b 液，与膜反应1 min，显影，定影，测蛋白条带的灰度值。3。5 流式细胞仪(fcm)检测细胞凋亡p38mapk 特异性抑制剂sb203580 处理rmg-i-h 细胞：选取指数生长期rmg-i-h 细胞制成单细胞悬液，以2×105/培养皿接种于35 mm 培养皿中，培养细胞接种至培养皿36 h后弃去10%胎牛血清的培养液，加入含0。1% dmso 的sb203580 培养液，浓度分别为0。1mm，1 mm，10 mm，另设同样浓度的0。1% dmso 为对照组，继续培养24 h，收集细胞。按annexin-v-fict/pi 试剂盒操作说明染色，利用流式细胞仪进行检测。3。6 统计学处理采用spss13。0 软件进行统计分析。计数资料用t 检验。 p<0。05 视为有统计学意义。4 结果。1 p38mapk、p-p38mapk 在细胞内的定位分析利用荧光染色法检测rmg-i 与rmg-i-h 细胞p38mapk、p-p38mapk 表达的定位，结果显示rmg-i与rmg-i-h的p38mapk蛋白定位在细胞质和细胞核，以细胞质为主(fig。1。a,b)，p-p38mapk 蛋白定位在细胞核(fig。1。c, d)。4。2 两种细胞系中fut-1、p38mapk、caspase-3 基因的表达利用rt-pcr 法分别检测rmg-i 与rmg-i-h 细胞中fut-1、p38mapk、caspase-3 基因的表达情况，结果显示：fut-1 基因在rmg-i-h 细胞中的相对表达强度明显高于rmg-i(p<0。05) (fig。 2a)；p38mapk 基因在rmg-i-h 细胞相对表达强度也明显高于rmg-i(p <0。05)(fig。2b)；而caspase-3 基因在rmg-i-h 的相对表达强度明显低于rmg-i(p <0。05) (fig。 2d)。4。3 两种细胞系中p38mapk、p-p38mapk、caspase-3 蛋白的表达利用western blot 法检测rmg-i 与rmg-i-h 细胞p38mapk、p-p38mapk 及caspase-3蛋白的表达，结果显示：rmg-i-h 细胞p38mapk 相对表达强度虽然没有显着差异(p >0。05)，但其磷酸化形式p-p38mapk 相对表达强度明显高于rmg-i(p <0。05) (fig。2c)，而caspase-3与基因的变化相一致，rmg-i-h 其相对表达强度明显低于rmg-i(p <0。05) (fig。2e)。4。4 抗lewis y 抗体处理后p38mapk 表达减少实验分三个组：实验组(加入lewis y 抗体)、空白组、对照组(加入兔抗人igg)。利用抗lewis y 抗体处理转染后细胞rmg-i-h，结果显示，与空白组和对照组比较，处理后细胞p38mapk 基因的表达强度明显降低(p <0。05)，并随着lewis y 单克隆抗体作用时间的延长而逐渐降低(p 均<