《干细胞研究及应用》PPT课件.ppt

1 干细胞研究及其应用 2 长期以来，人类一直在研究和寻找能治愈各 种疾病、抗衰老甚至长生不老的方法。 随着现代科学技术的发展，尤其是干细胞的 研究，人类的这些幻想正在逐步变成现实。 1998年，美国科学杂志将干细胞的研究 成果列在十大科学进展的首位。 3 干细胞研究历史及进展 4 干细胞的起源和进展 l1896 E.B Wilson首次用这个名词描述寄生虫生殖系的祖细胞 l1963 Till和McCulloch发现小鼠骨髓中存在能够自我更新的细胞 l1968 骨髓移植治疗重症联合免疫缺陷综合症(SCID)获得成功 l1978 在人类的脐带血中发现存在造血干细胞 l1981 Evans和Kaufman建立小鼠胚胎干细胞系 l1997 白血病起源于造血干细胞的发现证实了肿瘤干细胞的存在 l1996 克隆羊Dolly诞生 l1998 Thomson,James等建立第一个人胚胎干细胞系 l2000s 很多报道表明成体干细胞具有可塑性 l2001 美国Advanced Cell Technology公司的科学家首次采用克隆 技术培育出人类早期胚胎（6个分裂球） l2004-2005 韩国研究者黄禹锡(Hwang Woo-suk)声称利用利用体细胞核体细胞核 转移技术培育出几种人类胚胎干细胞系转移技术培育出几种人类胚胎干细胞系，后来被证实是伪造的 l2006 英国科学家用脐带血干细胞分化出第一个人造肝细胞 5 干细胞的起源和进展 l2007.1 科学家发现在羊水中存在一种新型干细胞，它可以在研究与治疗 中替代胚胎干细胞 l2007.6 3个研究小组同时报道发现小鼠正常的皮肤细胞可以重新 编程成为干细胞；同时科学家Shoukhrat Mitalipov首次报道通过体细 胞核转移技术制备猴胚胎干细胞成功 l2007.10 Mario Capecchi, Martin Evans和Oliver Smithies分获诺贝尔 生理和医学奖，奖励他们在胚胎干细胞和小鼠基因“敲除”方面的贡献 l2007.11 日本Yamanaka宣布成功把人体皮肤细胞（纤维原细胞） 改造成类似胚胎干细胞的多潜能干细胞诱导性多潜能干细胞 l2008.1 不需要破坏胚胎即可制备人类胚胎干细胞系（Advanced Cell Technology） l2008.1 美国科学家利用人的成纤维细胞核进行体细胞核转移技术获得了 人类的胚泡（囊胚） l2008.3 自体间充质干细胞成功治疗关节变性病 l2008.10 德国科学家成功把人类睾丸细胞改造成多潜能干细胞，美国科 学家将人类发根的角化细胞转化为类胚胎干细胞 l 6 1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufrnan 及美国加州大学的 Martin首次由小鼠中分离 得到鼠的胚胎干细胞。 至今已分离得到的胚胎干细胞物种有： 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994 ，1997）、鸡（1996）、恒河猴（1995）、 绒猴（1996）。 分离得到人的胚胎干细胞1998， 分离得到人的胚胎生殖细胞（1998）， 目前不断报道成年组织来源的的干细胞 。 7 何为干细胞 v干细胞定义 v干细胞生物学特点 v干细胞分类 v干细胞自我更新与分化调控 8 What are stem cells? Unspecialised Long-term self-renewal Ability to differentiate into specialised cells e.g. cardiac muscle cells, neurons, liver cells, etc. 9 干细胞的定义 干细胞（Stem Cells）是一群未分化的 ，具有自我更新 (self-renewal) 能力 和多向分化潜能(potency)的细胞。 它既能产生表型与基因型与母代完全 相同的子代细胞；也能产生组成机体 各组织和器官的高度分化的细胞。 10 干细胞的生物学特点 1.属低分化细胞，缺乏分化标记； 2.在机体的数目和位置相对恒定； 3.具有自我更新能力； 4.具有多向分化潜能，即具有分化发育的可塑性，其分 化受所处周围微环境（niche）的影响； 5.能无限地分裂、增殖； 6.分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期； 7.两种分裂生长方式：一是对称分裂，形成两个相同的 干细胞；二是不对称分裂，一个子代细胞保持干细胞 特性，另一个成为祖细胞，最终分化成终末细胞。 11 干细胞的生长分裂方式 12 干细胞的分类 v根据分化潜能分类 v根据发生发育学分类 13 干细胞根据分化潜能分类 1.全能干细胞（Totipotent stem cell） 2.多潜能干细胞（Pluripotent stem cell ） 3.多能干细胞（Multipotent stem cells ） 4.单能干细胞（Unipotent stem cell） 14 n全能（Totipotent）干细胞是指具有无限分化潜能 ，能分化成所有组织和器官的干细胞，包括胎盘。其 具有发育成完整个体的能力。 Totipotent cells have the potential to become l any type in the adult body l any cell of the extraembryonic membranes (e.g., placenta). 15 n多潜能（ Pluripotent）干细胞是 具有自我更新能力和高度增殖以及多 向分化潜能，并可以定向诱导分化为 三个胚层中所有种类的细胞，它可以 用来形成复杂的组织和器官。但与全 能干细胞相比，它失去了发育成完整 个体的能力，发育潜能受到一定限制 。 16 n自然状态下存在的三种多潜能干细胞 ： 胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES ）：来源于体外受精的胚泡的内细胞团； 胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells， EG）：来自胎儿性腺的原生殖细胞； 胚胎肿瘤细胞（Embryonic Carcinoma Cells, EC）：来自畸胎瘤，但为非整倍体 细胞。 17 n胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EG） 指来自于5-10周龄的胚胎性腺区的早期生殖细 胞。在发育后期，性腺区发育成睾丸或卵巢，原 始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）产生 精子或卵子。 n胚胎肿瘤细胞（Embryonic Carcinoma Cells, EC ） 是来源于恶性畸胎瘤的一种多潜能干细胞。畸 胎瘤是由机体内幼稚细胞发生变异而形成的肿瘤 。恶性畸胎瘤内既含有各种各样分化成熟的组织 ，还含有一些未分化的、能不断增殖的干细胞， 因其形态和发育潜能都类似胚胎细胞，而且是恶 性的，故称其为胚胎肿瘤细胞。 18 Human pluripotent embryonic stem (ES) and embryonic germ (EG) cells 19 n人工方法获得多潜能干细胞： 体细胞核移殖技术（Somatic cell nuclear transfer ，SCNT) 人工诱导的多潜能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPS） 20 SCNT and iPS 21 诱 导 性 多 能 干 细 胞 iPS induced pluripotent stem cells 22 n多能（Multipotent）干细胞是指能分化成与其来源 相近的特定组织或器官的干细胞（例如造血干细胞可 以分化为红血细胞、白血细胞和血小板等）。 23 Blood Cell Differentiation from Hematopoietic Stem Cells (HSCs). 24 n单能（Unipotent）干细胞只能产生一种细胞类型； 但是，具有自我更新属性，将其与非干细胞区分开。 如肝干细胞、胰腺干细胞、肠上皮干细胞、角膜缘干 细胞等。 受损的小鼠肝脏内，在 肝胆管周围存在FoxL1 表达阳性（水蓝色）的 肝干细胞，它们被肝纤 维细胞（品蓝）所包裹 ，构成了干细胞生存和 发挥功能的微环境。 25 26 干细胞根据发生学 来源分类 l胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs） 是指由胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）经体外抑制 培养，在传代过程中筛选出的具有多能性的细胞。 l成体干细胞（Adult stem cells） 是指存在于一种已经分化组织的未分化细胞，这种细胞 能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 。例如：造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞 、肝干细胞、皮肤表皮干细胞、胰腺干细胞等。 27 Types of stem cells ES cells Blastocyst (inner cell mass) Pluripotent 多能性 Easily grown in cultures Adult stem cell bone marrow, liver, pancreas, gastro. tract Homeostasis动态平衡 limited differentiation capacities; plasticity? Rare; hard to isolate and purify Potential transplant source; low risk of rejection排斥 28 胚胎干细胞（embryonic stem cells， ES细胞）是由早期 胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体 外分化抑制培养，在传代过程中筛 选出的具有多能性的细胞。包括胚 胎性生殖细胞 EGC（Embryonic Germ Cell）。研究和利用ES细胞 是当前生物工程领域的核心问题之 一。 29 30 ES cell =胚胎干细胞 EG cell = 胚胎生殖细胞 EC cell = 胚胎肿瘤细胞 SSEA = 阶段特异性胚胎抗原 TRA = 抑制肿瘤抗原-1 LIF = 白血病抑制因子 bFGF = 碱性成纤维细胞生长因子 EB = 胚体 31 成体干细胞ASC （Adult-derived Stem Cell ） 成年动物的许多组织和器官，比如 表皮和造血系统，具有修复和再生的 能力。成体干细胞在其中起着关键的 作用。在特定条件下，成体干细胞或 者产生新的干细胞，或者按一定的程 序分化，形成新的功能细胞，从而使 组织和器官保持生长和衰退的动态平 衡。 32 n成体干细胞的“可 塑性”（plasticity ） 造血干细胞 、骨髓间充质干细 胞、神经干细胞等 成体干细胞具有一 定跨系、甚至跨胚 层分化的特性。 Evidence of Plasticity Among Adult Stem Cells 33 特征胚胎干细胞(hESCs)成体干细胞 分化潜能 多潜能（Pluripotent）干细胞可诱导分化 成为三个胚层中所有种类的细胞 分化潜能多样，主要为多能（ multipotent ）干细胞 来源和分离方 法 体外受精剩余的胚胎或用体外核转移技术 (SCNT)获得胚胎，但SCNT成功率极低， 费用昂贵。技术要求高 虽然数目有限，个体特异性的成体干细胞较 容易获得。需要外科方法的的介入来分离组 织 (入骨髓穿刺、鼻粘膜活检等）。细胞分 离的技术要求不高 伦 理 主要的问题在于分离胚胎干细胞会破坏 胚胎，利用体外核转移技术对人类克隆 存在争论 该方面的问题较少，主要是提取成体干细胞 要获得捐助者的知情同意，分离的细胞是否 可以进行买卖等 体外培养与保 存 在体外细胞培养时能够自我更新，可以在 体外进行长期培养，并可以冻融。但体外 培养需要维持其稳定性（不分化），长时 间培养可能出现遗传的不稳定性 在体外培养很难生长，在体外环境中不能自 我更新 免疫原性 个体特异性的 hESCs (体外核转移技术) 在 细胞治疗中免疫性低 来自自体的干细胞治疗不会产生免疫反应 肿瘤形成 肿瘤形成率高，干细胞治疗的遗传不稳定 性 肿瘤形成率相对较低 细胞遗传修饰 容易进行遗传改造，细胞可以进行体外挑 选，但也可以产生不需要的突变 遗传改造较难（由于细胞数量少，而且难于 培养），可采用细胞融合进行基因治疗。 疾病传播风险 有病毒感染的风险（来自饲养细胞和血清 ），需建立不依赖饲养细胞、不依赖血清 生长的胚胎细胞系 异体移植需考虑配型 治 疗 目前尚无人体治疗和临床研究的报道已用于临床治疗（如治疗白血病和淋巴瘤） 34 干细胞治疗的进展 v科学家们认识到干细胞可能成为一种“拯救生命”的有效 的疾病治疗手段。 v例如：小剂量纯化的造血干细胞足可使患者骨髓再生， 可以避免肿瘤病人进行自体骨髓移植时所致的瘤细胞（ 尤其是白血病细胞）污染。 v例如：成熟的神经系统中存在的干细胞，在某些因素诱 导作用下，可增殖和定向分化，给神经退行性疾病（如 帕金森氏病）、骨髓损伤患者带来新的希望。 35 在我国，北京大学、协和医科大学、上海第二医科大学和 军事医学科学院等研究单位相继较早成立了专门的干细胞研 究基地，在造血干细胞研究和成体干细胞建库等方面已积累 了相当的经验。但对胚胎干细胞研究则很欠缺。 36 干细胞工程原理与技术 n干细胞的来源 n干细胞的分离和培养 n干细胞定向诱导分化 n干细胞检测方法 37 干细胞的研究热点 人体干细胞的建株； 干细胞保持不分化的培养； 干细胞的定向诱导分化； 干细胞应用的法律、伦理道德问题 ； 干细胞、组织工程、器官工程； 胚胎组织的种植及定向诱导分化。 38 干细胞工程 n细胞治疗（cytotherapy）是应用具有特定功能的细胞群或 细胞克隆治疗肿瘤、感染、自身免疫性疾病、基因缺陷等 疾病的一种涉及生物免疫学和基因学的治疗手段。 l第一代细胞治疗：全血输注； l第二代细胞治疗：骨髓和外周血干细胞移植； l第三代细胞治疗：在分离纯化少量干细胞基础上，通过细胞工程 技术，在体外扩增和定向诱导分化，或对其进行基因改造后，将 产生大量的目的细胞回输体内进行治疗。 n干细胞工程是利用干细胞的增殖特性，多向分化潜能及 其增殖分化的高度有序性，通过体外培养干细胞、诱导干 细胞定向分化，或用转基因技术处理干细胞以改变其特性 ，以达到利用干细胞为人类服务的目的。 39 干细胞工程 核移植 去核胚胎干细胞组装胚胎干细胞组织干细胞 各种组织器官 体 外 诱 导 培 养 40 胚胎干细胞研究的必要性和意义 为发育生物学研究提供合适的体外模型 发育生物学一直是生命科学的前沿领域，人类为揭示生命 发 生的奥妙不遗余力，其中关键问题就是要弄清楚生命是如何 从一个细胞（受精卵），通过分化发育，成为具有多种复杂的 组织、器官、系统的完整的有机个体。 41 胚胎干细胞工程 胚胎干细胞生物学研究的另一个重要领域是运用组织工程和 基因工程技术，体外对干细胞进行诱导分化，可识别靶基因，发 现新基因，并可进一步改造基因，然后用于体内组织缺陷性疾病 的细胞替代治疗和基因治疗，为临床应用开拓新途径。这部分研 究称为干细胞工程。 干细胞工程可用于由于多种因素（包括物理、化学、生物学 及病理损害等）造成的组织缺陷、一些重要组织器官（如神经系 统、中胚层来源的骨、软骨、肌肉等）的退行性病变，及某些严 重影响人类健康而又难于治疗的遗传发育缺陷性疾病。目前在这 一领域中，成体干细胞的研究工作已经取得成效，其中如造血干 细胞已广泛地应用于临床治疗。而胚胎干细胞的研究则处于起步 阶段。 42 干细胞的培养 43 早期干细胞来源 1. 直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法， 这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高， 由此会影响分离ES细胞的效率。 2. 卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养， 获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一 步分离得到胚胎干细胞。 44 现干细胞来源： (1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞 (2) 从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（ embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT） 去核卵细胞 + 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细 胞群 ES细胞 45 干细胞的来源 n干细胞的来源： 胚胎（体外受精、核移殖技术）、胎儿与新生儿脐带血、成体 46 干细胞的分离纯化 1.解离（散）组织制备细胞悬液：机械分离、酶学解 离或免疫疗法（immunosurgery） 人类胚胎干细胞的分离 47 干细胞的分离纯化 2.利用细胞体积和密度不同分 离纯化 3.利用细胞对不同基质的粘附 性不同分离细胞 Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008; 28(9):1584-95. 48 干细胞的分离纯化 4.利用细胞表面标志分离纯化 细胞表面标志（cell surface marker）存在于某种细胞表 面的特异性的表面蛋白，利用这些表面蛋白的特异性表达，应 用抗体结合或其他的方法可以检测或获得相应的细胞。 l流式细胞分选术 l免疫磁珠分选术 Identifying Cell Surface Markers Using Fluorescent Tags Microscopic Image of Fluorescent-Labeled Stem Cell 49 流式细胞术 Fluorescence activated cell sorting, FACS 50 免疫磁珠细胞分选（MACS） 51 培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛 血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸 ；-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。 52 目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑 葚胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因 此桑植胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。 ES细胞的分离 早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取 分化抑制物的选择, 包括：饲养层（feeder layer）， 条件培养基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基础培养基的选择 添加物的选用 53 人类胚胎干细胞体外培养方法 n与饲养细胞（feeder cells）共培养法 饲养层细胞是共同培养中用来维持多潜能干细胞未分 化特性的细胞，通常指胎鼠的成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF)。一旦脱离饲养层干细胞就 自发地进行分化。 n无饲养细胞培养法 54 与饲养细胞共培养法 n细胞培养： n细胞传代： /research/NIHresearch/scunit/culture.asp 55 无饲养细胞培养法 nFeeder-free culture mediem： l用含有小鼠胚胎纤维原细胞（MEFs）的代谢产物的hESC medium l在hESC medium中加入促进hESC增殖，但抑制hESC分化的因 子或化合物 /research/nihresearch/scunit/feederfree.htm 56 Why study stem cells? To understand SC properties and mechanisms Manipulate操作 Quantify量化 Many applications: Basic research, e.g. developmental biology, birth defects, cancer Transplantation research Therapeutic delivery system Drug screenings筛选 57 1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 2.永生化(immortal)； 3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 5.能参与胎儿所有组织的发育过程； 胚胎干细胞的性质 58 ES细胞的体外培养 （取自 干细胞和发育生物学 ， 叶鑫生等编，2000.4） 59 1. 各种动物的ES细胞与胚胎外胚层和生殖嵴的原始生殖 细胞类似形态结构，而与 ICM细胞有差异；胞体体积小，核 大，有一个或几个核仁。 3.细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖 体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。 4.ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞 紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清。 5.ES细胞增殖迅速，每1824h分裂增殖 1次。 6.此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。来自 一个克隆的细胞具有同样的特征。 （二）ES细胞的培养特性 60 ES细胞的高度分化潜能 ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点 1. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。 2. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体” “囊状胚体” 细胞分化物。 3. ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90以上的ES细胞 分化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成畸胎瘤，其细胞 组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。 61 62 碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞 和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小 鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而 在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或 阴性。猪、兔的桑格胚和早期囊胚AKP呈阳性。 因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分 化与否的标志之一。 63 胚胎阶段特异性细 胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性 表面抗原（SSEA1）。在胚胎的原始外 胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细 胞的表面均可检测到SSEA1的表达。小鼠 SSEA1的表达自8一细胞期开始，直到原 始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈 强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性， 部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA 也常作为ES细胞鉴定的一个标志。 64 干细胞特性干细胞特性 65 ES细胞的鉴定 - 细胞的形态结构 - 核型分析 - 碱性磷酸酶（AKP）染色 - SSEA-I 免疫荧光标记 - 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验 66 ES细胞形态学鉴定 依ES细胞的形态结构（胞 体体积小，核大、有一个或几个 核仁）和生长特性（呈克隆状生 长，细胞紧密聚集，形似鸟巢， 界限不清等）对ES细胞进行初步 鉴定。 67 核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型， 可用核型分析进行检验 68 碱性磷酸酶（AKP）染色 *常用快绿（Fast Green Staining)染色法， *对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑棋胚 或囊胚）作为阳性对照， *作用液中不含茶酚为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对 照无色。小鼠35日龄胚胎ICM为强阳性。 69 SSEA-I 免疫荧光标记 第1抗体，SSEA1（鼠抗ES细胞单克隆抗体）， 1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭 液，羊抗兔lgG。 步骤杜氏PBS洗3次,2 Triton作用20 min； 再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； 以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4过液； 以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30温箱置 30min； 再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞 是否出现荧光作出判断。 70 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成 核移植 71 干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内 72 目前研究的成体干细胞 （Adult Stem Cells） Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells( HSC ) Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC ) Fetal Liver Stem Cells Umbilical Cord Blood Stem Cells Neural Stem Cells “Studies suggest that stem cells in different adulttissues may be more similar than previously thought and perhaps in some cases have a developmental repertoire close to that of ES cells. ” Science, Volume 288, Number 5471, Issue of 2 Jun 2000, pp. 1660 - 1663 73 骨髓干细胞 Bone Marrow Stem Cells，HSC， 74 造血干细胞 v造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源 ，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中 。 v造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、 先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾 病的最有效方法。 v与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐 血干细胞移植的长处在于无来源的限制， 对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤 的污染。 75 /info/scireport/ 76 造血干细胞的鉴定： （1） 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1； （3）基因表达：TAL-1；GATA-2 ；H1；主要珠蛋白 77 造血干细胞作为干细胞研究 与应用的突破口 1. 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。 2. 造血干祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清 楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。 3. 造血干一祖细胞增殖及向各系分化的重要诱导因 子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。 4. 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、 神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因 此便于直接应用于临床。 78 Hematopoietic stem cells (HSC) A stem cell from which all red and white blood cells evolve演变 Bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood HSC markers mousehuman CD34low/- SCA-1+ Thy1+/low CD38+ c-Kit+ lin- CD34+ CD59+ Thy1+ CD38low/- c-Kit-/low lin+ 79 骨髓基质干细胞 80 肝脏干细胞 Fetal Liver Stem Cells 81 The oval cells response in many mammals, including humans. (Oval cells are the progeny of potentially pluripotential stem cells in liver.) 82 神经干细胞 Neural Stem Cells An adult neural stem cell has a very broad developmental capacity and may potentially be used to generate a variety of cell types for transplantation in different diseases. Science, Volume 288, Number 5471, Issue of 2 Jun 2000, pp. 1660 - 1663 83 神经干细胞 v神经干细胞的研究尚处初级阶段。理 论上讲，任何一种中枢神经疾病都可 归结为神经干细胞功能的紊乱。给帕 金森氏综合症患者的脑内移植含有多 巴胺生成细胞的神经细胞，可治愈部 分患者的症状。 84 神经干细胞 : （1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递 质的受体 （3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau， MAP2，微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋 白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白 ），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神 经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志） （4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡 蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的 基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发 现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和 GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L 的表达 85 An astrocyte monolayer that can be coaxed into becoming multipotent neural stemlike cells 86 A clone of newly generated neurons derived from a monolayer of astrocytic stemlike cells 87 A subpopulation of -Gal-immunoreactive neural stem cell progeny(A) is elongated and shows immunoreactivity for the muscle cell marker desmin (B). Some neural stem cell-derived cells are myosin heavychain-immunoreactive and show varying degrees of fusion and syncytia formation (C and D). Nuclei are visualized with blue Hoechst stain in (D). Generation of myocytes from adult neural stem cells 88 mammalian stem cells that can give rise to neurons 89 脂肪组织干细胞 90 Researchers Transform Human Fat To Provide Stem Cells： Tissue Engineering vol 7, p 209，2001 Researchers Transform Human Fat Into Bone, Muscle, Cartilage 91 上皮干细胞 92 内皮细胞 : （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛 胞内连接；大量吞饮泡 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31 ；细胞粘附分子整合素v3 ；CD34 ；JAM (Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2 93 Structural-proliferative units. In this model of tissue organization, each glandular structure is maintained by slow cellular turnover. 94 Some types of important stem cells Hematopoietic stem cells (HSCc)造血干细胞 Cells that are normally responsible for replacing the red and white blood cells that age and die every day in our bodies.(it was well used to treat the leukaemia and other blood disease) Neural stem cells神经干细胞 like HSCc , can proliferate in a laboratory culture dish and can be kept undifferentiated or induced to differentiate into specialize cell types(have a great contribute to treat Parkinsons disease) 95 人类干细胞研究的应用 -干细胞工程 1. ES系统已经成为基因功能研究的有效手段 2. ES细胞系建立后，可从最根本上揭示人及 动物发育过程中的决定基因 3. ES细胞可作为评价新药及化学产品的毒性 及效能的检测系统 4. ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组 织器官移植的最佳来源 96 The Business of Stem Cells Science, Volume 287, Number 5457 Issue of 25 Feb 2000, pp. 1419 - 1421 Eliot Marshall Betting on Stem Cells Company name Location Employees Specialty Aastrom Biosciences Ann Arbor, MI 33 Hematopoietic stem cells Geron Corp. Men lo Park, CA 100 Embryonic, fetal stem cells Layton BioScience Atherton, CA 25 Fetal neural stem cells NeuralSTEM Bethesda, MD 14 Fetal neural stem cells Biopharmaceuticals Neuronyx Inc. Malvern, PA 10 Neural stem cells Nexell Irvine, CA 120 Hematopoietic stem cells Therapeutics Inc. Osiris Therapeutics Baltimore, MD 75 Mesenchymal stem cells ReNeuron London 17 Neural stem cells Stem Cell Sciences Melbourne, Australia - Embryonic stem cells StemCells Inc. Sunnyvale, CA 16 Adult neural stem cells 97 Successful Trial of Gene Therapy in France Uses “Adult” Stem Cells Science 288, 669-672, April 28, 2000. French researchers recently reported what appears to be the first successful trial of human gene therapy, boosting the immune systems of two infants with severe combined immunodeficiency by injecting them with their own stem cells containing a normal copy of the gene that they lacked. Researchers removed stem cells from the infants bone marrow, added a working copy of the gene to the cells DNA, and injected the repaired stem cells back into the infants (8 and 11 months old at the time of treatment) 98 Adult Stem Cells Reverse Diabetes in Mice Nature Medicine 6, 278-282, March 2000 Researchers at the University of Florida announced in March that they have reversed diabetes in mice using adult pancreatic stem cells. The pancreatic stem cells were harvested from adult donors and grown in culture, where they formed small functional organs known as islets of Langerhans (the insulin- secreting parts of the pancreas.) The cells were then injected under the skin of the diabetic mice, where they began secreting insulin. Within 7-10 days, the mice were able to regulate the levels of glucose in their blood. . 99 Bone Marrow Stem Cell Transplant Used to Treat Children with Cartilage Defect Nature Medicine 5, 309-313, March 1999 Bone marrow-derived stem cells have been used clinically to treat children with osteogenesis imperfect, a condition that leads to multiple fractures, severe bony deformities, and considerably shortened stature. Three months after treatment, the three children showed changes indicating new dense bone formation. The report by researchers at St. Jude Childrens Hospital in Memphis indicates the promising possibility for treatment of this as well as similar stem cell disorders. 100 Neural Stem Cells Able to Repair Damage Throughout Brain Sciences USA 96, 7029-7034, June 8, 1999 In studies with mice, neural stem cells have been shown to globally replace damaged brain tissue. The study, performed by researchers at Harvard Medical School, involved transplanting neural stem cells from born mice into the brains of “shiverer” mice, a model for Parkinsons and similar central nervous system diseases. The neural stem cells were able to migrate throughout the brain to repair damaged tissue. Treated mice showed a decrease in tremors. 101 Corneal Stem Cells Help Restore Sight New England Journal of Medicine 340, 1697-1703, June 3, 1999 Corneal stem cells have been used by doctors in Japan to restore useful vision to patients who were legally blind. Transplants of adult corneal stem cells were used for conditions in