血小板源性生长因子受体基因重排的研究.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减血小板源性生长因子受体基因重排的研究（作者:_单位: _邮编: _） 【关键词】 血小板源性生长因子 受体 骨髓增殖性疾病 血小板源性生长因子（PDGF）是血清中的一种强有丝分裂原分子，分子质量为2831 ku。PDGF可刺激成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞的增殖，其受体在人巨核细胞和巨核细胞系有表达。PDGF一方面通过与其受体相互作用刺激细胞的cfos的表达，促进细胞有丝分裂，另一方面它可作用于骨髓微环境的间质细胞，使间质细胞产生更多的细胞因子，间接促进巨核细胞的生长，与TPO、IL1、IL3、IL6等协同促进巨核细胞克隆的形成。目前发现PDGF受体（PDGFR）基因重排可导致受体酪氨酸激酶分子调控机制及信号转导通路的持续性激活和造血干细胞的克隆性生长，基因重排在部分骨髓增殖性疾病（MPD）的发生发展中起着重要作用。1 PDGF受体结构及其功能自1979年首次分离纯化以来，目前发现PDGF家族至少包含有4名成员（PDGFA、B、C、D）和5种二聚体形式(PDGF AA、 PDGF AB、 PDGF BB、 PDGF CC和PDGF DD)，其中PDGFB与猴肉瘤病毒转化蛋白（vsis）同源，具有促使细胞进入细胞周期G1S期的活性。PDGF受体（PDGFR）包括两种结构相似的酪氨酸激酶受体PDGFR、，两者同属型酪氨酸激酶受体家族，其共同结构包括胞外区5个免疫球蛋白样结构域,1个穿膜结构域,1个ATP结合位点和1个胞内亲水激酶插入域。1 PDGFR主要在胚胎期神经嵴细胞及体节的发育过程中起着重要作用，PDGFR则主要参与血管壁细胞的发育，具有吸附和促进外膜细胞、平滑肌细胞增殖的作用，在血管形成后期发挥重要作用，同时还参与中枢神经系统(CNS)、外周神经系统(PNS)、神经细胞、胶质细胞的增殖、分化和生存。在成人组织中，配体结合的PDGFR还能刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的迁移，各种基质蛋白质和胶原酶的产生，促进肉芽组织的形成，在创伤愈合、新生血管形成、骨骼肌再生、组织重塑过程中都起着重要的作用。 2 PDGF受体表达调控机制PDGFR与配体结合后发生受体各亚单位二聚化，酪氨酸激酶区活化和自身磷酸化反应。磷酸化的酪氨酸残基为几种细胞内信号分子的SH2结构域提供结合位点。信号分子包括经典的磷脂酰肌醇激酶3 (P13K)，可与Sosl形成复合体的转接分子Grb2、作用于Ras的核交换分子、磷脂酶c (PLCw)、酪氨酸激酶Src、酪氨酸磷酸酶SHP2及RasGAP(GTP酶激活蛋白)，直接或间接激活下游激酶，引起转录因子活化，启动靶基因的转录。PDGFR表达调控不仅在转录水平，在蛋白水平也受到严密的调控。配体与受体结合后，发生受体二聚化反应并被持续激活，同时产生受体酪氨酸磷酸化，在网格蛋白介导的内吞体和胞膜窖处聚集，PDGFR直接与抑制受体激酶的凹陷蛋白亚型相互作用2，引起不同信号转导通路级联反应的发生，在细胞有丝分裂、细胞骨架重排、趋药性选择等与生长增殖密切有关的事件中起重要作用。目前认为，PDGF和PDGF信号转导在肿瘤血管的生成中发挥重要作用，主要机制可能与肿瘤细胞、血管内皮细胞表达PDGFR有关。PDGFR与其配体结合可直接提高细胞间黏附分子的降解，促进肿瘤的侵袭与转移，同时还可经间接途径激活邻近组织细胞、平滑肌细胞，释放VEGF、FGF等生长因子促进血管生成，参与并促进恶性肿瘤的间质反应。3 由PDGFR基因重排生成的融合蛋白4q12包括疏水半胱氨酸丰富区CHIC2位点长约800kb碱基对的中间缺失（而非染色体易位）导致FIP1L1（酵母蛋白Fip1样蛋白）基因、PDGFR基因断裂，由FIP1L1的223个氨基酸和PDGFR的523个氨基酸形成融合基因，该融合基因首先被发现存在于急性嗜酸粒细胞性白血病(CEL) 细胞株EOL1上。基因断裂位点在不同的高嗜酸粒细胞增多综合征（HES）病人虽略有差异，但位置相对固定一般位于FIP1L1基因内含子710和PDGFR基因内含子12范围内。由于此类基因异常未能被标准的细胞遗传学显带技术所检测，故此类HES病人染色体核型通常表现正常。 3.1 融合基因激活机制 FIP1L1是一个具有520个氨基酸序列的酸性蛋白，包含有与Fip1同源的42个氨基酸序列的保守基序，功能可能与转录调控相关。Gotlib等3在对鼠Ba/F3细胞株的研究中发现，FIP1L1/PDGFR融合蛋白可持续活化细胞酪氨酸磷酸激酶，导致细胞不依赖于IL3而无限生长。在对克隆性HES及该融合蛋白阳性的CEL病人的检测中也发现，该融合基因被持续激活导致蛋白发生自身磷酸化，激活STAT5信号转导通路，但激活机制不依赖于MAPK途径，这可能与PDGFR的亚细胞定位有关。存在该融合基因异常的HES病例在疾病终末多急变为白血病4。Yamada等5的裸鼠体内实验发现，仅移植FIP1L1/PDGFR融合蛋白阳性的造血干祖细胞（F/P+ HSCs/Ps）的小鼠只发生慢性粒细胞白血病（CML）样疾病表现，不发生HES。而移植过表达IL5的F/P+ HSCs/Ps的小鼠发病则同人类HES相似，在对部分HES病人的检测中也发现存在T细胞依赖的IL5过表达的现象，提示HES/CEL的发生可能还与IL5的过表达密切相关。目前关于FIP1L1/PDGFR融合基因在细胞信号转导中的具体激活机制尚待进一步研究。 3.2 临床治疗应用 HES、CEL和肥大细胞疾病(MCD)主要是以外周血持续性嗜酸性细胞增多为共同表现的一大类血液系统异质性疾病。除血液系统改变外，还常可导致包括心血管系统、皮肤黏膜、神经系统以及肺部等机体器官组织的多种浸润症状。目前经典的治疗仍包括一线化疗药物羟基脲及皮质激素的应用。细胞实验发现，低剂量伊马替尼（剂量为抑制BCR/ABL融合基因的1/100）即能有效抑制FIP1L1/PDGFR融合基因的持续活化。Wadleigh等6的临床试验发现， 伊马替尼对BCR/ABL阳性的CML病人的治疗剂量在为400 mg/d，而FIP1L1/PDGFR阳性的HES患者只需服100 mg/d7，即可达到血液学和细胞分子学的完全缓解。同时也发现伊马替尼并非对所有患者均有疗效，PDGFRATP结合位点的突变常导致复发病例发生获得性耐药。16名HES患者中，9名(56%)被检出存在伊马替尼的作用靶点，尚有约40%病人不存在上述融合基因，提示该疾病存在异质性。Lierman等8临床研究还发现伴有T674I突变、FIP1L1/PDGFR阳性的CEL病人也对伊马替尼耐药。Western蛋白印迹试验证实，Sorafenib可直接作用于FIP1L1/PDGFR及T674I基因，有效抑制T674I突变鼠Ba/F3细胞株的增殖，诱导EOL1细胞株的凋亡，可望成为逆转CEL病人T674I突变的另一有效手段。另外，Pardanani等9临床试验发现部分系统性肥大细胞疾病（SMCD）患者有与HES相似的分子病理机制。FISH证实，5名伴嗜酸性粒细胞增多的SMCD患者中，3名患者早期造血祖细胞存在该融合基因，其中1名患者的中性粒细胞和单核细胞同时检测到该融合基因，所有3名患者均对伊马替尼治疗反应良好，而另2名FIP1L1/PDGFR阴性的患者治疗则无效。4 由PDGFR基因重排生成的融合蛋白 41 TEL/PDGFR 染色体t(5;12) (q33;p13) 易位产生TEL/ PDGFR融合基因，导致突变蛋白的寡聚和信号转导的持续激活，原本IL3依赖的Ba/F3 和 32D小鼠细胞出现不依赖IL3的快速增殖，小鼠模型发生进展性致死性的MPD，表现为迅速出现的白细胞减少、脾大和髓外造血。TEL(ETV6)属转录因子ETS家族，是白血病基因重排的一个热门位点，野生型TEL具螺旋转角螺旋基序，包含5端寡聚结构域PNT区域和羧基端DNA结合域。体外实验10表明，TEL能诱导细胞停滞在G1期。TEL/ PDGFR由TEL氨基末端的154个氨基酸和PDGFR的穿膜、胞浆区域融合形成。其中，PDGFR氨基酸Tyr579、 Tyr581与MPD的发生、发展密切相关11，PDGFR磷酸化位点氨基酸序列酪氨酸苯丙氨酸 (TyrPhe)的改变和PNT区域是该融合蛋白形成的必要结构，可促使融合蛋白多聚化。 42 其他类型PDGFR基因重排生成的融合蛋白 在部分慢性粒单核细胞性白血病（CMML）患者中存在获得性染色体t(5;17)(q33;p13) 易位所致的rabaptin5/PDGFR融合基因，该融合蛋白大多由野生型rabaptin5蛋白和PDGFR的穿膜区、胞内区、酪氨酸激酶区融合形成。rabaptin5/PDGFR融合基因转染鼠Ba/F3 细胞株的实验表明，融合基因同样可导致细胞的恶性增殖和致死性MPD的发生。Magnusson等12对该融合蛋白的结构分析发现，该融合蛋白包括34个螺旋卷曲域、2个caspase3 切割位点和1个抑癌基因的结合位点，通过配体诱导的网格蛋白介导的细胞内吞调节多种生长因子受体介导细胞生长。非典型CML患者体内尚存在染色体t(5;10)(q33;q22)易位，H4 基因5端序列同PDGFR基因3端序列融合形成的H4/ PDGFR融合基因，编码WW样穿膜酪氨酸结构域。H4氨基酸末端亮氨酸拉链区域（5593位氨基酸、101384位氨基酸）诱导Ba/F3细胞出现不依赖于生长因子的无限生长，H4/ PDGFR融合基因移植小鼠还可发生T淋巴母细胞性淋巴瘤样疾病。另外，存在染色体t(5;7)(q33;q11.2) 易位的CMML患者还可产生Huntingtin蛋白1?(HIP1)/ PDGFR融合蛋白（HIP1/PDGFR融合蛋白），染色体t(5;14)(q33;q32) 易位的复发型急性单核细胞性白血病患者（AMLM5）可产生CEV14/PDGFR融合蛋白等多种与PDGFR基因重排相关的融合蛋白。 4.3 融合基因激活机制 TEL/ PDGFR融合基因在恶性转化的Ba/F3和32D细胞株上，可促使磷脂酶C (PLC1)、SHP2和JNK的磷酸化，激活STAT1、STAT513，但后者非细胞恶性转化所必须。同时该融合蛋白还具有BCR/ABL样作用，上调癌基因cmyc，与PI3激酶p85亚单位形成复合物。PI3激酶在细胞生长、迁移、代谢、细胞骨架形成等各环节都起着重要作用，活化的PI3激酶介导D3细胞下游磷脂酸肌醇脂(PtdIns) 羟基衍生物PtdIns(3,4)P2 、 PtdIns(3,4,5)P3磷酸化，促使下游一系列蛋白如，靶蛋白丝氨酸激酶Akt/PKB活化，调节核糖体、NFB活性及p70S6激酶的活化。TEL/ PDGFR同PI3协同信号转导调节cdk4激酶复合物，进而调节细胞生长周期，导致细胞株生长因子非依赖性生长。该融合基因的这一作用能被伊马替尼抑制，并发现在作用数小时后，胞浆cdk4激酶活性和细胞周期调节蛋白D、E表达降低。酪氨酸激酶抑制剂CGP 57148体内试验也发现具有抑制该融合蛋白，抑制细胞恶性转化的作用。 4. 4 临床治疗应用 Cain等14在对具有TEL/PDGFR融合基因鼠髓细胞株和小鼠模型应用酪氨酸激酶6(RTKs)受体多靶点抑制剂SU11657发现，SU11657能有效抑制32D小鼠细胞TEL/PDGFR激酶的活化，逆转该融合基因诱导的细胞非生长因子依赖性增殖，抑制作用呈剂量依赖性，服安慰剂组小鼠的平均生存期只有33 _+14.2 d，而SU11657治疗10周组小鼠的平均生存期为116 _+ 22.5 d (P =0.0035)，治疗14周小鼠组平均生存期为137 _ +18.6 d(P=0.0018)，且对不存在靶蛋白的正常细胞不发生相似的抑制作用。上述动物实验表明，SU11657具有减少外周血白细胞计数，延长MPD小鼠生存时间的作用，实验观察中未发现有明显耐药的发生。最近一项肿瘤模型研究还发现，配体激活PDGFR导致肿瘤基质组织间液体压增加，提示PDGF激酶抑制剂还可能通过降低组织间液压力增加抗肿瘤药物的摄取，增强细胞毒性药物的疗效15。5 展 望 随着分子肿瘤学、分子药理学研究的深入发展，关于肿瘤细胞内细胞周期调控、细胞凋亡诱导、信号转导、细胞与胞外基质的相互作用等各种关键事件正被逐步阐明，PDGFR为肿瘤治疗提供了一个新的治疗靶点。PDGFR拮抗剂与其他治疗的协同应用，具有广阔的临床应用前景。当前以肿瘤细胞特异性分子为结合靶点以及模拟的药物的研究开发，特别是一些与肿瘤分化增殖相关的细胞信号转导通路关键酶的药物靶点的筛选，发现与靶点特定结合的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为未来抗肿瘤药物研究开发的新方向。【参考文献】 1 REILLY JT. 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