克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用课件

克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用 Clinically Suspicious LN Biopsy Morphology with IHC If necessary, Molecular Dx Cytogenetics/ FISH Evaluation of the Suspicious Lymph Node Carcinoma v. Lymphoma FNA With Flow Cytometry Suspect Lymphoma Carcinoma CLL Suspect Lymphoma, Negative or Non-diagnostic Workup for PrimaryDiagnosis Staging and Treatment FISH Treatment NCCN NHL Lymphoma Guidelines （5-10%） 分子和细胞遗传学异常 抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常 l简要原理 l检测方法 l应用和策略 l注意事项 淋巴细胞表面受体 l IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11) l TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2 IG和TCR基因结构及重排过程 胚 系 可变区恒定区 胚系 D-J重排 V-D-J重排 转录与拼接 各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性 IGH IGKIGLTCRATCRBTCRGTCRD V664338464768 D277656546798 J655611354 淋巴细胞发育过程中基因重排顺序 IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR ：TCR 淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排 不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标 克隆性重排的检测方法 Southern 杂交 PCR法 特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 Southern 杂交 优点： 敏感性较高 可靠性高 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代 PCR法 原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段 新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。 引物的选择原则 l引物位置：PCR产物长度10-15bp l引物本身的长度0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值 。 必须结合临床病史 Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志： 某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉 T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间 前T细胞性白血病/细胞淋巴瘤几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大 约20%同时伴有IGH基因重排 前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型均有IGH DJ 区克隆性重排 70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮 助 毛细胞白血病共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多 点亚型转换阻滞 T细胞大颗粒淋巴细胞白血病TCR，TCR克隆性重排，存在TCR ，TCR交叉 NK细胞慢性淋巴细胞增生异常没有IG和TCR克隆性重排 侵袭性NK细胞白血病没有IG和TCR克隆性重排 结外NK/T 细胞淋巴瘤，鼻型大多IG及TCR无重排，少数因存在反应 性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排 肝脾T细胞淋巴瘤TCR克隆性重排 来源的存在等位的TCR克隆性重排 来源的一部分存在TCR克隆性重排 ，一部分未产生TCR克隆性重排 蕈样霉菌病部分存在TCR克隆性重排 原发性皮肤CD30+T细胞淋巴增生性 疾病 60%存在TCR克隆性重排，TCR克隆 性重排与淋巴瘤相关 原发皮肤T细胞TCR克隆性重排；TCR克隆性重 排可能存在或缺失，但不表达 血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤75-90%：TCR克隆性重排 25-30%：IG克隆性重排，与EBV+B 细胞相关 间变大细胞淋巴瘤，ALK+90%存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关，10%不存在IG和 TCR克隆性重排 间变大细胞淋巴瘤，ALK-多数存在TCR克隆性重排与是否表 达T细胞抗原无关 肠病型T 细胞淋巴瘤（EATL）TCR，TCR克隆性重排在各种形 态学亚型均存在 T细胞幼淋巴细胞白血病TCR、TCR克隆性重排 (1) 少量淋巴细胞 (2) 小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反应性T细胞 (3) EBV或CMV感染 (4) 免疫抑制患者 (5) 淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,重排多样性受限 制,可出现寡克隆信号。 假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带 辨别方法： 多次重复，大小不同的条带 只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带 3. 假克隆和寡克隆 4.淋巴瘤重排检出率不是100% 假阴性 原因： （1）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏 基因重排 （2）引物不全 （3）与其他基因重排、突变； （4）体细胞超突变(eg. MCL vs FL) （5）检测敏感性限制 （6）所用检测技术分析技术 （7）不合适的退火温度 解决办法：多组引物组合， 仔细分析 仅用一对引物时 滤泡性淋巴瘤IG重链和轻链重排；由于其可变区存在大量的体细胞突 变，导致单对引物不易扩增出单克隆产物（10-40%）。 多重PCR(BIOMED-2)引物可以检测出90%的IGH(V-D- J)基因重排，用此引物可以检测出100%IGH(D-J)和轻 链基因重排 慢性淋巴细胞性白血病/ 小淋巴细胞性淋巴瘤 40-50%未突变的病例中存在IG基因重排，在未突变的病 例BCR的意义非常重要，常和自身抗体反应相关 幼B淋巴细胞白血病50%：IG未突变的重链克隆性重排。所有病例具有VH3 （68%）和VH4（32%）基因家族 MALT淋巴瘤IG重链，轻链重排以及可变区体细胞突变 结内边缘带淋巴瘤VH3和VH4家族明显突变的IG基因克隆性重排 儿童结内边缘带淋巴瘤IG基因克隆性重排在区别该病和反应性增生作用大 原发皮肤滤泡中心淋巴 瘤 具有体细胞高突变的克隆性IG重排，但有些不能被PCR 检测到 套细胞淋巴瘤IG克隆性重排，可变区基因大多未突变，但15-40%存在 低量的突变。 弥漫性大B细胞淋巴瘤非特殊类型可检测到IG重链和轻链的克隆性重排 可变区存在体细胞高突变 富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴 瘤 肿瘤B细胞存在IG克隆性重排，IG存 在体细胞突变和生发中心的细胞一致 。 5假阳性： 技术原因；PCR法影响因素多，严格分区 各种原因所致的假克隆或寡克隆 产物分析区 空气流向 空气流向空气流向空气流向 缓冲间缓冲间缓冲间 专用走廊