原生质体培养与诱变2012课件

第六章 原生质体培养与诱变 原生质体培养 原生质体变异 1 原生质体培养 原生质体： 是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、 裸露的、有生活力的 原生质团。 无细胞壁 具有活细胞的特征 原生质体培养：将细胞去除细胞壁后形成裸露的原 生质体，把原生质体放在无菌的人工条件下使其生 长发育的技术。 特点： 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导 分化成完整植株： 原生质体培养 1.1 原生质体分离纯化 1.1.1 酶解法 一般用植物的体细胞（二倍体细胞）， 采用果胶 酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原 生质体。 特点： 操作简单 分离效果好 细胞基本可保持完整性 n分离原生质体主要是酶解法 首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料 分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成 薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤 维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植 物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需 酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液1030ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压 浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的 酶液中须加入0.55molL甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只 加0.40.45molL的甘露醇，两者差别较大。 酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下 放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下 表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于 悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛 过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。 附：原生质体制备的操作步骤 n从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得 到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。 所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生 长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不 能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。 n花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的 材料。下面以多年生大花萱草为例，介绍原生质体的制备和融合方法。 n1.取盛开的大花萱草作为实 验材料。我们可以看到在每 一个花瓣上都具有红、黄、 白三种颜色。 花瓣表皮为排列紧密的表皮组织，不易 酶解，用尖头镊子撕去表皮。 （A）将暴露的花肉组织浸泡在酶液里 。 （B）排列相对疏松的花肉细胞很容易 被酶液消化。 n2. 在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。 因此要用显微镜随时检查酶解情况。 点 击 观 看 动 画 演 示 3. 酶解好的原生质体经300 目尼龙网过滤到离心管中， 除去未消化的大块组织。 4.离心5分钟（500-1000转/分） ，使悬浮的原生质体下降至离 心管底部，缓缓倾倒出上清液 。加入培养液，吹打使其悬浮 ，再离心，重复2次，目的是洗 去酶液，使原生质体悬浮在等 渗培养基中。 n显微镜检查清洗后的原生质体，如碎片过多，则用蔗糖 漂浮法去除碎片。 n蔗糖漂浮方法： 细口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生质体 悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出。由于比重不 同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。 离心5分钟（500转/分），此时死细胞及碎片降至 蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量 泡沫，故漂浮在上下界面处。 用细管轻轻插入底部将沉将在离心管底部的碎片小 心吹打，混匀在蔗糖溶液中，连同蔗糖溶液一起小心吸 出， 再吸去上清液即得到健康的原生质体。 1）离心沉淀法 经酶解处理后得到一个由原生质体、细胞团和细胞碎片组成的混合液 ，需要进一步纯化。常用的纯化方法有： 离心沉淀法 是 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先行过滤再 低速离心，使原生质体沉淀于试管底部。该方法比较简单，由于原生质体 沉淀在一起相互挤压，常引起原生质体破碎。 1.1.2 原生质体的纯化 经酶液处理的原生质体悬浮液用400目网 筛过滤后，滤液经5001000r/min离心 56min吸去上清液，用一般洗涤液（如 一定浓度的甘露醇）或专用洗涤液（ 0.45mol/L甘露醇，10mmol/L CaCl2.H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH5.6 ）重新悬浮离心，如此重复23次。最 后收集沉积于试管底部的原生质体。 n2）漂浮法 n 应用渗透剂含量较高的高渗溶液使原生质体漂浮于 液面。该方法能够获得比较纯净的原生质体；由于存在高 渗溶液对原生质体的破坏作用，仅能获得少量的完好原生 质体。 n 首先依照离心沉淀收集原生质体，之后将沉淀用洗涤 液（3%蔗糖、0.4mol/L甘露醇、1480mg/L CaCl2.2H2O ）或用11%23%蔗糖液洗涤离心（400800r/min,310min ）23次，收集漂浮在溶液表面的原生质体，最后用培养 液洗涤一次。 n3）界面法 n采用两种比重不同的溶液，其中一种溶液的密度大于原生 质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体 即处于两种溶液界面之间。该方法可防止因挤压引起原生 质体破碎，原生质体收获量较大。 n首先依沉淀法收集原生质体，再用培养液离心沉淀一次， 将沉淀置于23ml培养液中悬浮。取10ml离心管加入8ml 18%的蔗糖溶液，再取2ml原生质体悬浮液铺于其上，以 700r/min离心2min，此时大量原生质体集中于培养液与蔗 糖溶液之间，轻轻吸取原生质体，再用培养液离心洗涤一 次，即可获得纯净的原生质体。 n1.2 原生质体的活力测定 n分离纯化后的原生质体需要检查活力并调整好起始密度后才能进行培养 。对于新分离出来的原生质体的活力有以下几种测定方法。 n1.2.1 形态识别 n 形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体有活力。若将形态 上正常的原生质体放入低渗洗液或培养基中，可见到分离时缩小的原生 质体又恢复原态。一般正常膨大的原生质体都是有活力的原生质体。 n1.2.2 活体染色 n 用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色后即进行观察，有活力而质膜完整 的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的原生质体能立即被染 上色。 n1.2.3 荧光染料活体染色 n 用双醋酸盐荧光素（FAD）对原生质体进行染色，染料可自由透过 原生质体质膜进入内部，进入后由于受到原生质体内酯酶的分解，而产 生有荧光的极性物质荧光素，它不能自由出入质膜，并在膜内堆积。在 荧光显微镜下可根据产生的荧光，判断原生质体的活力。 1.3 原生质体培养与植株再生 n1.3.1 原生质体培养及其意义 n1）原生质体培养 （前面已述） n2）原生质体培养的意义 n1、为细胞融合提供培养方法 n2、为遗传转化提供培养方法 n原生质体由于没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA ，电穿孔法、PEG 法等基因转化方法是 以原生质体作为受体细胞。 n3、利用培养变异选育新品种 n4、用于细胞器的分离与转移 n原生质体由于没有细胞壁的障碍，可以进行许多遗传操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核 、染色体等的摄取。摄取后，再进行培养，再生植株。根据再生植株以及后代的表现，进行 遗传分析，研究某种细胞器功能或控制的性状等。也可以转移以上细胞器，培育新品种。 n5、用于理论研究 n细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染机理等。 n原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等研 究领域得到广泛应用。 原生质体培养的意义 3）原生质体的培养类型 （1）液体浅层培养 将原生质体用培养液调整到一定细胞 密度，取出34ml置于培养皿中浅层静止 培养的方法。 （2）固体薄层培养 即平板培养，指将一定体积的原生质体按照一定 细胞密度与等体积的处于45的琼脂培养基混合，在 培养皿内制成薄层固体平板的方法。 特点： 原生质体位置固定 避免其游动 便于定点观察 （3）双层培养 分为固体-固体双层培养和液体-固体双层 培养。 A、固体-固体双层培养 指将等体积的琼脂与一定浓度的原生质体 悬浮液混合，涂布在固体琼脂培养基表面的方 法。 B、液体-固体双层培养 将一定浓度原生质体悬浮液涂布在固 体琼脂培养基表面的培养方法。 特点： 液体培养与固体培养的结合 利于原生质体的生长 利于营养成分的逐步释放 利于有害成分的扩散 （4）琼脂糖珠培养 用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液 混合均匀，然后以0.5ml左右的液滴滴入培养 液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种 方法。 1.3.2 原生质体再生 原生质体再生过程 指分离、纯化的原生质体在适当的培 养方法和培养条件下，恢复细胞壁，再生 细胞持续分裂形成细胞团，最后通过愈伤 组织或胚状体分化出完整植株的过程。 原生质体再生 1）细胞壁再生 有活力的原生质体具有再生和分裂的潜在能力 细胞壁的再生是细胞分裂的先决条件 原生质体培养数小 时后开始再生细胞壁，两天至数天 细胞壁再生完成。 分离的健康原生质体在各方 面条件都合适的时候,会很快再 生出新的细胞壁。因植物种类 、取材的器官或组织的不同， 细胞壁开始再生的时间也不同 。 一般情况下，由培养细胞和 幼嫩组织分离的原生质体，再 生壁开始得比较早，而对于叶 肉原生质体，则需要较长的时 间才能再生出新的细胞壁。 2）细胞分裂 再生细胞不一定进行有丝分裂 原生质体植板率变化很大 不正常的有丝分裂 原生质体再生 3）植株再生 原生质体培养形成的愈伤组织转移到分化培养基中，可 形成不定芽和不定根或形成胚状体结构后直接发育成植株。 当原生质体形成新细胞壁后，就进入细胞分裂阶段，持续分裂的结果 就形成细胞团或愈伤组织。由细胞团或愈伤组织再生成完整植株可以通过 两条途径来完成，一是愈伤组织诱导形态发生；另一途径是由植株原生质 体细胞系在培养过程中直接诱导形成胚状体，并且可以继续形成极性，即 下端生根、上端分化芽，从而发育成完整植株。 当原生质体再生的愈伤组织长到1-5mm时，可以转接到分化培养基上。分 化培养基与原生质体培养基的区别在于：不加渗透压稳定剂，只加蔗糖做 碳源；提高细胞分裂素的浓度，降低生长素浓度。在分化培养基产生的苗 一般没有根，需转接到生根培养基中以促进根的形成。 原生质体再生 原生质体培