分子实验基本操作培训

分子实验实验 基本操作培训训 余涛，郑勤思 2008-4-13 IGEM PKUCount Group Outline vv 分子分子实验实验实验实验 基本流程介基本流程介绍绍绍绍 vv 分子分子实验实验实验实验 基本操作的原理、步基本操作的原理、步骤骤骤骤及注意事及注意事项项项项 vv 总结总结总结总结 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本流程介绍绍 vv 感受感受态态态态的制的制备备备备 vv PCRPCR克隆目的片断克隆目的片断 vv 酶酶切及切及酶酶切片断回收（切片断回收（电电电电泳）泳） vv 连接连接 vv 小提小提质质质质粒并粒并酶酶切切鉴鉴鉴鉴定（定（电电电电泳）泳） vv 大大肠肠肠肠杆菌的培养杆菌的培养 vv 转化转化 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本流程介绍绍 vv 感受感受态态态态的制的制备备备备 vv PCRPCR克隆目的片断克隆目的片断 vv 酶酶切及切及酶酶切片断回收（切片断回收（电电电电泳）泳） vv 转转转转化化 vv 连连连连接接 vv 小提小提质质质质粒并粒并酶酶切切鉴鉴鉴鉴定（定（电电电电泳）泳） vv 大大肠肠肠肠杆菌的培养杆菌的培养 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 vv 原理原理 大大肠肠肠肠杆菌在杆菌在37 37 下在下在较较较较好好较较较较快的快的进进进进行增殖，行增殖， 4 4 下下则则则则可可较较较较好停止代好停止代谢谢谢谢，便于保存。（，便于保存。（长长长长期保存期保存应应应应在在-80 -80 用用15-20%15-20%甘油甘油冻冻冻冻存）存） 由于由于转转转转入的入的质质质质粒粒带带带带有抗性有抗性标记标记标记标记 ，用，用带带带带有抗生素的培有抗生素的培 养基即可养基即可进进进进行行选择选择选择选择 性培养。性培养。 vv 分分为为为为固体培养基培养和液体培养基培养固体培养基培养和液体培养基培养 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 vv Step0: LBStep0: LB培养基的配制培养基的配制(1L(1L培养基含培养基含) ) 10g Tryptone 10g Tryptone 5g Yeast Extract 5g Yeast Extract 10g NaCl 10g NaCl 15g Agar 15g Agar ( (仅仅仅仅在固体培养基中加入，注意在固体培养基中加入，注意琼琼琼琼脂脂为为为为AgarAgar琼琼琼琼脂糖脂糖/Agarose/Agarose区分区分) ) 1L 1L 去离子水去离子水 vv 一般一瓶配一般一瓶配100-300mL100-300mL vv Step0: Step0: 灭灭灭灭菌（此后一切保持无菌操作）菌（此后一切保持无菌操作） IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 固体培养基培养固体培养基培养 （用于（用于筛选筛选筛选筛选 或短期保存菌种）或短期保存菌种） vv Step1: Step1: 倒板倒板 微波炉加微波炉加热热热热培养基培养基 - - 室温冷却至室温冷却至60 60 左右左右 - - 移入超移入超 净净净净台，加入抗生素（台，加入抗生素（1000*1000*的，即需稀的，即需稀释释释释10001000倍），倍）， 摇摇摇摇匀匀 - - 趁趁热热热热快速倒入平板，快速倒入平板，12mL/12mL/板板 - - 超超净净净净台内室台内室 温冷却凝固温冷却凝固 vv Step2: Step2: 接种接种 划划线线线线法：法：烧红烧红烧红烧红 接种接种环环环环 - - 冷却冷却 - - 蘸上菌液蘸上菌液 - - 在平板在平板 上划上划线线线线 -灼灼烧烧烧烧接种接种环环环环。 多用于菌种保存多用于菌种保存 平平铺铺铺铺法：用玻璃刮刀将菌液法：用玻璃刮刀将菌液铺铺铺铺干与平板上，多用于干与平板上，多用于转转转转化化 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 固体培养基培养固体培养基培养 vv Step3Step3：3737培养箱中培养。注意需要先正置培养箱中培养。注意需要先正置10min10min（ 防菌液倒流）再倒置培养（防止染防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂杂杂杂菌）。注意培养菌）。注意培养时时时时 间间间间不可不可过长过长过长过长 ，一般不超，一般不超过过过过1616小小时时时时，防止突，防止突变变变变株株产产产产生。生。 vv Step4Step4：培养：培养结结结结束后，需放入束后，需放入4 4 冰箱的，冰箱的，为为为为防止染防止染杂杂杂杂 菌，最好用菌，最好用parafilmparafilm封口。封口。 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 液体培养基培养（用于液体培养基培养（用于扩扩扩扩增）增） vv Step1Step1：取出适量培养液于：取出适量培养液于锥锥锥锥形瓶或形瓶或试试试试管。管。 vv Step2: Step2: 加入适量抗生素。加入适量抗生素。 vv Step3Step3：将目：将目标标标标菌落挑入培养液。（可用接种菌落挑入培养液。（可用接种环环环环或或枪头枪头枪头枪头 ） vv Step4: Step4: 将培养液放入将培养液放入37 37 摇摇摇摇床中培养，床中培养，转转转转速一般速一般为为为为 220rpm220rpm。（。（为为为为什么要什么要摇摇摇摇？）？） IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作大肠肠杆菌的培养 注意事注意事项项项项： vv 无菌操作！无菌操作！ vv 抗生素加入的抗生素加入的时时时时机及量机及量 vv 培养培养时间时间时间时间 （不可（不可过长过长过长过长 ） 返回返回 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作感受态态的制备备 vv 原理：原理： 感受感受态态态态 - - 可接受外来可接受外来DNADNA的状的状态态态态 CaCl CaCl 2 2 法制法制备备备备 Ca2+ Ca2+可以使膜骨架可以使膜骨架发发发发生改生改变变变变，产产产产生膜生膜 上的小孔洞，并可使上的小孔洞，并可使DNADNA分子分子结结结结合并合并进进进进入入细细细细胞内。胞内。 vv 步步骤骤骤骤：比：比较较较较麻麻烦烦烦烦，属，属较较较较考考验验验验分子操作的分子操作的实验实验实验实验 之一。往往之一。往往 大批量制大批量制备备备备，因此不需，因此不需经经经经常常进进进进行。行。 vv 注意事注意事项项项项：感受：感受态态态态制制备备备备后后应应应应立即立即冻冻冻冻存于存于-80-80。使用。使用时时时时 不可反复不可反复冻冻冻冻融。融。 返回返回 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 vv 原理：原理： 限制性内切限制性内切酶酶： 1 1）发现发现发现发现 于于细细细细菌中，用于降解噬菌体的菌中，用于降解噬菌体的DNADNA；宿主自身；宿主自身 的的DNADNA则则则则被甲基化。被甲基化。 2 2）分）分为为为为I I、IIII、IIIIII类类类类。常用。常用IIII类类类类（识别识别识别识别 位点与位点与酶酶切位切位 点一致）点一致） 3 3）区）区别别别别与外切与外切酶酶活性（内切活性（内切酶酶彻彻彻彻底切断底切断DNADNA双双链链链链，外，外 切切酶酶只切其中一只切其中一链链链链，往往用于，往往用于DNADNA复制的复制的实时检验实时检验实时检验实时检验 。）。） vv 分分类类类类：单单单单切和双切切和双切 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 单单单单切：切： vv Step1: Step1: 酶酶切体系的切体系的选选选选定定 确定确定选选选选用的用的酶酶 - - 查查查查找找对应对应对应对应 高效率的高效率的bufferbuffer（常用的（常用的 bufferbuffer有有H, M, L, K, T H, M, L, K, T 五种），确定要不要加五种），确定要不要加BSABSA vv H, M, L, K, T buffer H, M, L, K, T buffer 都有什么？都有什么？ H-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-AcetateH-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-Acetate B-L, G-M, O-H, R-K, Tango-TB-L, G-M, O-H, R-K, Tango-T IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 vv Step2: Step2: 配制配制酶酶切体系：切体系： vv 以以10uL10uL体系体系为为为为例例 0.5uL 0.5uL 内切内切酶酶（含（含50%50%甘油防甘油防冻冻冻冻） 1uL Buffer (10*) 1uL Buffer (10*) 5uL 5uL 质质质质粒粒 3.5uL 3.5uL 去离子水去离子水 vv 原原则则则则： 1 1） 甘油含量不可超甘油含量不可超过总过总过总过总 体系体系5%5%，防止星火性，防止星火性 2 2） 质质质质粒可根据具体情况粒可根据具体情况调调调调整整 3 3） 内切内切酶酶切切记记记记不可置于常温！不可置于常温！ IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 vv Step3: Step3: 置于置于3737培养箱中，温育培养箱中，温育2-4h2-4h。（用水浴也可。（用水浴也可 以，但可能会使溶液因蒸以，但可能会使溶液因蒸发发发发而而产产产产生生浓浓浓浓度不均匀）。注意度不均匀）。注意 有些特殊的有些特殊的酶酶所需的条件有所不同，主要是温度条件。所需的条件有所不同，主要是温度条件。 vv Step4: Step4: 纯纯纯纯化，方法同化，方法同PCRPCR片段片段纯纯纯纯化。化。 vv Step5: Step5: 电电电电泳泳检测检测检测检测 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 双切：双切： vv Step1: Step1: 酶酶切体系的切体系的选选选选定定 确定确定选选选选用的两种用的两种酶酶 - - 查查查查找找对应对应对应对应 双切的双切的BufferBuffer，同，同时时时时看看 与分与分别单别单别单别单 切的高效切的高效bufferbuffer是否吻合是否吻合 - - 确定要不要加确定要不要加 BSABSA vv Step2: Step2: 配制配制酶酶切体系。与切体系。与单单单单切切类类类类似，但需要注意似，但需要注意酶酶的用的用 量。（甘油含量不可超量。（甘油含量不可超5%.5%.） vv Step3: 37Step3: 37温育温育2-4h2-4h vv Step4: Step4: 凝胶回收凝胶回收 IGEM PKUCount Group 分子实验实验 基本操作酶切及酶酶切片断回收切片断回收 凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集纯纯纯纯化。化。 vv Step1: Step1: 电电电电泳，泳，电电电电泳泳过过过过程中称重一小离心管。程中称重一小离心管。 vv Step2: S