PCR技术综述.doc

pcr技术综述08生工李国辉聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称pcr）又称无细胞分子克隆系统或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异dna片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的dna得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是基因扩增技术的一次重大革新。pcr技术可将极微量的靶dna特异地扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力，能检测单分子dna或对每10万个细胞中仅含1个靶dna分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。1、pcr技术的发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了dna的体外操作。khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过dna变性，与 合适的引物杂交，用dna聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆trna基因”。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的dna聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家kary mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了pcr技术，并在science杂志上发表了关于pcr技术的第一篇学术论文。其原理类似于dna的体内复制，只是在试管中给dna的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板dna，寡核苷酸引物，dna聚合酶，合适的缓冲体系，dna变性、复性及延伸的温度与时间。从此，pcr技术得到了生命科学界的普遍认同，kary mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的pcr技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，keohanog改用t4dna聚合酶进行pcr，提高了扩增的真实性。尔后，saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的dna聚合酶，使得pcr技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得pcr技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，pcr方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的dna片段。到目前为止，pcr技术已有十几种之多，例如，将pcr与反转录酶结合，成为反转录pcr，将pcr与抗体等相结合就成为免疫pcr等。2、pcr技术的基本原理dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链dna在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在dna聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，dna在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制dna的变性和复性，并设计引物做启动子，加入dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制。pcr的过程类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性-退火(复性）-延伸三个基本反应步骤构成：模板dna的变性：模板dna经加热至93左右维持一定时间，使含有所需扩增分析序列的靶dna双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知dna序列由人工合成的与所扩增的dna两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的dna片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与dna单链的结合；模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；引物的延伸：dna模板-引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，于72左右，以4种三磷酸脱氧核苷（dntp）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，按5到3方向将引物延伸、自动合成新的dna链、使dna重新复制成双链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增dna产物增加1倍，经反复循环，使靶dna片段指数性扩增。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3、pcr技术的反应体系与反应条件（一）标准的pcr反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dntp混合物 各200umol/l引物 各10100pmol模板dna 0.12ug taq dna聚合酶 2.5umg2+ 1.5mmol/l加双或三蒸水至 100ul（二）pcr反应五要素： 参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、dntp、模板和mg2+（1）引物： 引物是pcr特异性反应的关键，pcr 产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用pcr就可将模板dna在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（2）酶及其浓度。目前有两种taq dna聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反应约需酶量2。5u(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3）dntp的质量与浓度。dntp的质量与浓度和pcr扩增效率有密切关系，dntp粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1m naoh或1m tris。hcl的缓冲液将其ph调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dntp降解。在pcr反应中，dntp应为50200umol/l，尤其是注意4种dntp的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低pcr产物的产量。dntp能与mg2+结合，使游离的mg2+浓度降低。（4）模板(靶基因)核酸。模板核酸的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k来消化处理标本。sds的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于pcr反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于pcr扩增。rna模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。（5）mg2+浓度。mg2+对pcr扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的pcr反应中，各种dntp浓度为200umol/l时，mg2+浓度为1.52.0mmol/l为宜。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。（三）pcr反应条件的选择：pcr反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于pcr原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链dna在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度taq dna酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致pcr失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板dna变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变性，就会导致pcr失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板dna 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：tm值(解链温度)=4(g+c)2(a+t)复性温度=tm值-(510)在tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高pcr反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：taq dna聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/s/酶分子70 60核苷酸/s/酶分子55 24核苷酸/s/酶分子高于90时， dna合成几乎不能进行。pcr反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的dna片段，延伸时间1min是足够的34kb的靶序列需34min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数的设置：循环次数决定pcr扩增程度。pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 4、pcr反应的基本步骤标准的pcr过程分为三步：1。dna变性（90-96）：双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna。2。退火（复性）（25-65）：系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链。3。延伸（68-75）：在taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dntp为原料，从引物的5端3 端延伸，合成与模板互补的dna链。每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量既增加一倍。现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。5、pcr 反应参数1。 变性：在第一轮循环前,在94下变性5-10min 非常重要,它可使模板dna 完全解链,然后加入taq dna聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使pcr 失败,因为未变性完全的dna 双链会很快复性,减少dna 产量。一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下,双链dna 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含gc 的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2。 退火：这是pcr 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的tm 低5, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物tm 不同，将退火温度设定为比最低的tm 低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。3。 延伸：延伸反应通常为72,接近于taq dna 聚合酶的最适反应温度75。实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为taq dna 聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中,taq dna聚合酶每分钟约可合成1kb 长的dna。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4。 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于dna 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使pcr 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中taq dna 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的dna 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:cco(1+p)n 。其中：c 为扩增产物量, co 为起始dna 量, p 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。6、提高pcr 扩增特异性1。 递减pcr（touchdown pcr）递减pcr 通过在pcr 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的tm 高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2（当然，也可以每几个循环降12），直到退火温度低于tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减pcr 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如aflp dna 指纹分析。2。 热启动热启动pcr 是除了好的引物设计之外，提高pcr 特异性最重要的方法之一。尽管taqdna 聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行pcr 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于dna 工程的遗传元件的构建和操作，热启动pcr 尤为有效。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。限制taq dna 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr 反应液，并将其置于预热的pcr 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟dna 合成，直到pcr 仪达到变性温度。包括延缓加入taq dna 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。3。 促进pcr 的添加剂退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高gc 含量的模板，需要其他的措施。影响dna 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。pcr 添加剂，包括甲酰胺，dmso，甘油，甜菜碱以及pcrx enhancer solution 可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助dna 聚合酶延伸通过二级结构区。pcrx solution 还有其他优点。在同platinumtaq dna 聚合酶和platinum pfx dna 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制taq dna 聚合酶的dmso，甲酰胺和甘油。4。 巢式pcr使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式pcr 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式pcr 可以增加有限量靶序列（如稀有mrna）的灵敏度，并且提高了困难pcr（如5 race）的特异性。7、pcr扩增产物分析 pcr产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。pcr产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：pcr产物电泳，eb溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。pcr产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重pcr，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据pcr产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测pcr产物特异性的有力证据，也是检测pcr 产物碱基突变的有效方法。southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与pcr产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测pcr产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将pcr产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于pcr产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测pcr产物特异性的最可靠方法。8、pcr反应特点（1）特异性强pcr反应的特异性决定因素为：引物与模板dna特异正确的结合；碱基配对原则；taq dna聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及taq dna聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。（2）灵敏度高pcr产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，pcr的灵敏度可达3个rfu(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。（3）简便、快速pcr反应用耐高温的taq dna聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在dna扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。（4）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，dna 粗制品及总rna均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的dna扩增检测。 9、pcr操作中常见的问题及分析1、pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。2、假阴性，不出现扩增条带 pcr反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及,pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。(1)模板：模板中含有杂蛋白质,模板中含有taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。 (2)酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加taq酶或溴乙锭。 (3)引物:引物质量,引物的浓度,两条引物的浓度是否对称,是pcr失败或扩增条带不理想,容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看od值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做pcr有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。 (4)mg2+浓度:mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大,浓度过高可降低pcr扩增的特异性,浓度过低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。 (5)反应体积的改变:通常进行pcr扩增采用的体积为20ul,30ul,50ul。或100ul,应用多大体积进行pcr扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。 (6)物理原因:变性对pcr扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性,退火和延伸温度,这也是pcr失败的原因之一。(7)靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其pcr扩增是不会成功的。3、假阳性 出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。 (1)引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行pcr扩增时,扩增出的pcr产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。 (2)靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出pcr产物,而导致假阳性的产生,可用巢式pcr方法来减轻或消除。 4、出现非特异性扩增带 pcr扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补,或引物聚合形成二聚体。二是mg2+离子浓度过高,退火温度过低,及pcr循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性,65左右退火与延伸)。 5、出现片状拖带或涂抹带 pcr扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dntp浓度过高,mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。减少dntp的浓度。适当降低mg2+浓度。增加模板量,减少循环次数。 10、pcr技术的应用进展pcr技术自1985年建立以来,发展之迅速,应用之广泛,表明其具有强大的生命力。近些年来,基于pcr的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对pcr技术进行研究和改进,使pcr技术得到了进上步地完善,并在此基础上派生出了许多新的用途。1、原位pcr技术 原位pcr就是在组织细胞里进行pcr反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的pcr技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。 原位pcr是hasse等于1990年建立的,实验用的标本是新鲜组织,石蜡包埋组织,脱落细胞,血细胞等。其基本方法为固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛处理,再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶k消化处理:用60ug/ml的蛋白酶k将固定好的组织细胞片55消化处理2h后,962min以灭活蛋白酶k。pcr扩增:在组织细胞片上,加pcr反应液,覆盖并加液体石蜡后,直接放在扩增仪的金属板上,进行pcr循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位pcr的装置。杂交:pcr扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。显微镜观察结果。原位pcr既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的pcr。 2、连接酶链反应 连接酶链反应(ligasechainreaction,lcr),是一种新的dna体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。 连接酶链反应是backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明,并申报了专利。1988年landegren也进行了该项研究。1988年backman等又因分离热稳定的连接酶,而申报专利,1991年backman和barany分别用耐热dna连接酶进行了lcr试验。耐热dna连接酶可以在热循环中保持活性,提高连接反应的特异性,排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序。 lcr的基本原理为利用dna连接酶。特异地将双链dna片段连接,经变性-退火-连接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。其程序为:在模dna,dna连接酶,寡核苷酸引物以及相应的反应条件下,首先加热至一定温度下(9495)使dna变性,双链打开,然后降温退火(65),引物与之互补的模板dna结合并留下一缺口,如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补,dna连接酶即可连接封闭这一缺口,则lcr反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行,每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板,使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变,引物不能与靶序列精确结合,缺口附近核苷酸的空间结构发生变化,连接反应不能进行,也就不能形成连接产物。 lcr的引物是两对分别互补的引物,引物长度为2026个,以保证引物与靶序列的特异性结合,lcr识别点突变的特异性高于pcr,其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合,其次是耐热连接酶的特异性。lcr连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(tm),因而识别单核苷酸错配的特异性极高。 lcr的扩增效率与pcr相当,用耐热连接酶做lcr只用两个温度循环,94min变性和65复性并连接,循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用点突变的研究与检测,微生物病原体的检测及定向诱变等,还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断,微生物的种型鉴定,癌基因的点突变研究等。 3、依赖核酸序列的扩增 依赖核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification,nasba),又称自主序列复制系统(self-sustainedsequencereplication,3sr)或再生长序列复制技术。1990年guatelli等首先报道了这一技术。nasba主要用于rna的扩增,检测及测序。该反应有赖于amv逆转录酶,t7rna多聚酶和核酸酶h(rnaseh)共同协作而完成。 nasba反应体系中除含有上述三种酶外,还含有dntp,ntp(核糖核苷), 两种特殊的引物和缓冲液。引物i3末端与靶序列互补,5端含t7rna多聚酶的启动子,这一引物是用于合成cdna的。引物的碱基序列与cdna的5未端互补。 在nasba反应时,首先引物与rna模板复性(结合),amv逆转录酶催化合成cdna,rnaseh水解cdna上的rna,形成一条单链的dna;引物随即与此cdna的5未端结合,逆转录酶在此dna模板的指导下合成第二条dna链。这样形成的dna双链含有t7rna多聚酶的启动子。该酶即以此dna为模板,转录出与样品rna序列相同的rna链,而且每条dna模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的rna。每条新的rna又可作为逆录酶的模板合成cdna。如此反复进行,将获得更多的rna和cdna。 其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,651min使rna分子二级结构打开,降温至37加入逆转录酶,t7rna聚合酶和rnaseh,并在37反应11。5小时,其产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。nasba的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于pcr,特异性好。 4、转录依赖的扩增系统 转录依赖的扩增系统(transcript-basedamplificationsystem,tas),是kwen等人于1989年研究报道的,主要用于扩增rna。 合成a,b引物,引物a的3末端与待扩增rna互补,其5端有t7rna多聚酶的启动子信息。逆转录酶以a引物为起点合成cdna;引物b与此cdna3端互补合成cdna第二链。逆转录酶除具有逆转录活性外,还有dna多聚酶的活性及rnaseh的活性。t7rna多聚酶又以此双链dna为模板。转录出与待扩增rna一样的rna,这些rna又可作为下轮反应的模板。t7rna多聚酶的催化效率很高,一个模板可转录10103个rna拷贝,因而反应液中待检rna的数量以10的指数方式扩增。 tas的主要特点是扩增效率高,因为其rna拷贝数呈10的指数方式增加,只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2106。它的另一个特点是特异性高,由于tas只能进行6次温度循环,错掺率低,加之用葡聚糖珠夹心杂交,因而特异性也高。虽然本法有较高的特异性和敏感性,但其循环过程复杂,需重复加入逆转录酶和t7rna多聚酶,有待进一步研究。 5、q复制酶反应 kacian等于1972年首次报报q复制酶(q-betareplicase)催化rna模板的自我复制功能,它能在常温30min,将其天然模模mdv-1rna扩增至109。1986年chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针,可与亲和素联接的mdv-1rna杂交,经洗脱未被结合的mdv-1后,再加入q复制酶,扩增复制mdv-1拷贝,然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交。 q复制酶是一种rna指导的rna聚合酶,它有3个特点:不需寡核苷酸引物的引导就可启动rna的合成。能特异地识别rna基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的rna折叠结构。在q复制酶的天然模板mdv-1rna的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制。因而,如在此区插入核酸探针,则其序列照样可能被q复制酶扩增。 1988年lizardi等,将靶基因序列插进mdv-1质粒里,用t7rna聚合酶催化转录出mdv-1rna探针,这种rna探针可与靶序列杂交,然后洗去非杂交的探针,加入q复制酶来扩增探针,被扩增的探针又可作为模板进行扩增,并呈指数递增。其产物按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法,分子开关和靶依赖的复制等技术。 6、标记pcr和彩色pcr 标记pcr(labelledprimers,lp-pcr),lp-pcr是利同位素或荧光素对pcr引物的5端进行标记,用来检测靶基因是否存在。彩色pcr(colorcomplementationassaypcr,ccapcr),是lp-pcr的一种。它用不同颜色的荧光染料;标记引物的5端,因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料,通过电泳或离心沉淀,肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况,此法可用来检测基因的突变,染色体重排或转位,基因缺失及微生物的型别鉴定等。 7、反向pcr 反向pcr(reversepcr)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规pcr扩增的是已知序列的两引物之间dna片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段dna进行酶切,然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行pcr,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究。 8、不对称pcr 不对称pcr(asymmetricpcr)是用不等量的一对引物,pcr扩增后产生大量的单链dna(ssdna)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50100:1。在pcr反应的最初1015个循环中,其扩增产物主要是双链dna,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导的pcr就会产生大量的单链dna。不对称pcr的关键是控制限制性引物的绝对量,需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等