高中生物基因工程ppt课件资料

1-11-1 DNADNA重组技术重组技术 的的基本工具基本工具和和基本操基本操 作程序作程序 专题专题1 1 基因工程基因工程 一一 基因工程的基本内容基因工程的基本内容 主要内容主要内容 （一）基因工程的概念（一）基因工程的概念 （二）基因工程的基本工具（二）基因工程的基本工具 （三）基因工程的基本操作程序（三）基因工程的基本操作程序 （四）基因工程的应用（四）基因工程的应用 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程又叫基因工程又叫基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重重 组技术组技术。该技术是在。该技术是在生物体外生物体外，通过对，通过对 DNADNA分子进行人工分子进行人工“ “剪切剪切” ”和和“ “拼接拼接” ”，对生，对生 物的基因进行物的基因进行改造改造和和重新组合重新组合，然后，然后导入导入 受体细胞受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在内进行无性繁殖，使重组基因在 受体细胞内受体细胞内表达表达，产生出人类所需要的，产生出人类所需要的基基 因产物因产物。 复习复习 基因工程的别名基因工程的别名 操作环境操作环境 操作对象操作对象 操作水平操作水平 基本过程基本过程 结果结果 基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术 生物体外生物体外 基因基因 DNADNA分子水平分子水平 人类需要的基因产物人类需要的基因产物 剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达 实质实质 基因重组基因重组 复习复习 基因工程基因工程培育抗虫棉的培育抗虫棉的简要过程简要过程： 普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) ) 苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌 提取提取 抗虫基因抗虫基因 与与运载体运载体DNADNA拼接拼接 导入导入 棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) ) 棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) ) 复习复习 基因工程的关键步骤：基因工程的关键步骤： 关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内细胞内提取出来提取出来 关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNADNA连接连接 关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞 复习复习 解决基因工程关键步骤需要的工具解决基因工程关键步骤需要的工具 关键步骤一的工具：关键步骤一的工具： 关键步骤二的工具：关键步骤二的工具： 关键步骤三的工具：关键步骤三的工具： 限制性内切酶限制性内切酶 DNADNA连接酶连接酶 运载体运载体 复习复习 基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 限制酶是在生物体限制酶是在生物体( (主要是主要是微生物微生物) )内的一种酶内的一种酶 ，能将外来的，能将外来的DNADNA切断切断，由于这种切割作用是在，由于这种切割作用是在 DNADNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。分子内部进行的，故名限制性内切酶。 特点：特异性。特点：特异性。 即即一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸序核苷酸序 列列，并且能在，并且能在特定的切点特定的切点上切割上切割DNADNA分子。分子。 复习复习 识别序列 大多数限制酶的 识别序列由6个 核苷酸组成。 也有少数限制酶 识别序列由4、5 、或8个核苷酸 组成。 迄今为止，有迄今为止，有300300多种多种 微生物中分离出微生物中分离出40004000 种限制酶种限制酶 大肠杆菌大肠杆菌( (E.coliE.coli) )的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别 GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在GG和和A A之间切开。之间切开。 限制酶限制酶 限制限制 酶酶 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口 ，带有几个，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好 互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。 平末端 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 提问提问 要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的，然后让两者的 黏性末端黏性末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组的起来，就似乎可以合成重组的 DNADNA分子了。分子了。 2 2、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝之间的缝 隙隙“ “缝合缝合” ”起来，即把梯子两边扶手的断起来，即把梯子两边扶手的断 口连接起来，这样一个重组的口连接起来，这样一个重组的DNADNA分子分子 就形成了。就形成了。 E.coliDNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘 性末端的连接 T4DNA连接酶 从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘 性末端的连接，又能用于平末端的连接 ，但是平末端的连接效率低。 为什么要用运载体？ 1 1、直接将目的基因连接到受体细胞的、直接将目的基因连接到受体细胞的DNADNA 上不能表达。上不能表达。 2 2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且 在受体细胞中能够复制和表达的载体来用在受体细胞中能够复制和表达的载体来用 于表达。于表达。 作为运载体必须具备哪些条件作为运载体必须具备哪些条件 1 1）能够在宿主细胞中）能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。 2 2）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以，以便与外源基因连接便与外源基因连接。 3 3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的 基因等。基因等。 常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类： 1 1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒 2 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒 质粒：质粒： 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的的 遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌 细胞中核区外的细胞中核区外的DNADNA分子。现在习惯上用分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核核 以外的以外的DNADNA分子分子。 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用最常用的的运载体运载体。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNADNA 分子分子。有的一个细菌中有一个，有的一个。有的一个细菌中有一个，有的一个 细菌中有多个。细菌中有多个。 大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒最常用的质粒是是大大 肠杆菌的质粒肠杆菌的质粒，其中常，其中常 含有含有抗药基因抗药基因，如四环，如四环 素的标记基因。质粒的素的标记基因。质粒的 存在与否对宿主细胞生存在与否对宿主细胞生 存没有决定性作用存没有决定性作用，但，但 复制只能在宿主细胞内复制只能在宿主细胞内 成成。 原核细胞的基因结构(补充内容） 非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子终止子 不编码蛋白质。 ：编码蛋白质 ,连续不间断编码区 非编码区 原核 细胞 的 基因 结构 调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子 真核细胞的基因结构（补充内容） 编码区非编码区非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 真核 细胞 的 基因 结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用,上游有启动子，下 游有终止子 非编码序列： 包括非编码区和内含子 原核细胞真核细胞 不同点 编码区是 _的 编码区是间隔的 、_的 相同点 都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续不连续 编码区 非编码 四个基本步骤：四个基本步骤： 三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序 1 1）提取提取目的基因目的基因 2 2）目的基因）目的基因与运载体结合与运载体结合 3 3）将目的基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞 4 4）目的基因的）目的基因的检测检测和和表达表达 目的基因目的基因 目的基因是人们所目的基因是人们所 需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因 。 如苏云金芽孢杆菌如苏云金芽孢杆菌 的的抗虫基因抗虫基因，还有植物，还有植物 的的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细抗细 菌菌）基因基因、种子、种子贮藏蛋贮藏蛋 白的基因白的基因，以及人的，以及人的胰胰 岛素基因岛素基因、干扰素基因干扰素基因 等。等。 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪 去多余部分 目的基因 限制酶 1、目的基因的获取 1目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 2获取目的基因的常用方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 概念：基因文库 （gene library） 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 分别含有这种生物的不同的基因,称为基因 文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基 因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分 基因,这种基因文库叫做部分基因文库. 基因组文 库与部分 基因文库 的关系 cDNA文库的构建 mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 双链DNA 反转录法： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。 利用PCR技术扩增目的基因 PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术，可 获取大量的目的基因。 DNADNA序列自动测序仪：序列自动测序仪： PCRPCR技术技术： 对提取出来的对提取出来的 基因进行核苷酸基因进行核苷酸 序列分析。序列分析。 使目的基因的片使目的基因的片 段在短时间内成百段在短时间内成百 万倍地扩增。万倍地扩增。 v 人工合成 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 3、基因表达载体（重组质粒）的构建 （1）用一定的_切 割质粒，使其出现一个切口 ，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的_ 处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 1过程: 2基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 位于基因的首端,是 mRNA结合位点 位于基因的末端,终 止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 条件条件 步骤二步骤二：目的基因与运载体重组目的基因与运载体重组 1 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现 一个切口一个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其，使其 产生产生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切的切 口处，再加入适量口处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了一，形成了一 个个重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。 质粒 目的基因 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 表 达 载 体 同一种 过程: 2、基因表达载体的作用 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有 目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌 、酵母菌和动植物细胞等。、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。 步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 1 1）将细菌用）将细菌用CaClCaCl 2 2 处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细 胞壁的通透性胞壁的通透性。 2 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体 细胞。细胞。 3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很 短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌 转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的TDNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表 达 载 体 导入 植 物 细 胞 插入植物细胞 染色DNA 表达 新 性 状 转入 农 杆 菌 （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序: 提纯含目的基 因表达载体 取受精卵显微注射移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理 大肠杆菌 感受态 细胞 表达载体 与感受态 细胞混合 感受态细 胞吸收 DNA 步骤四：步骤四：目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 四环素四环素 抗性基因抗性基因 氨苄青霉氨苄青霉 素抗性基因素抗性基因 (四)目的基因的检测与鉴定 检测 导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法 DNA分子杂交 表达检测 转录检测分子杂交 翻译检测抗原抗体杂交 分 子 检 测 法 鉴定 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 个体水平的鉴定 不能，受体细胞必须表现出特定的性状不能，受体细胞必须表现出特定的性状 ，才能说明目的基因完成了，才能说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因 完成了表达吗？完成了表达吗？ 若若不能表达，不能表达， 要对抗虫基因要对抗虫基因 再进行再进行修饰修饰。 知识延伸DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链 DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或 化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的 同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。 返返 回回 DNA 附着在膜上 硝化纤维素 加探针 报告基因（含荧光素分子） 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） a b c d 复习题 1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?( 试举例说明) 2）简述农杆菌转化法 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶 结合位点 外显子内含子 终止子 基因的结构 启动子 原核 真核 1 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列酸序列 B B、质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接