米非司酮对体外培养子宫肌瘤细胞作用的形态学观察

【摘要】 目的 观察不同浓度米非司酮作用下体外培养的子宫肌瘤细胞的形态学变化，寻找治疗子宫肌瘤的最佳米非司酮浓度。方法 光镜及电镜下观察不同浓度米非司酮(10-810-4mol/L)下体外培养的子宫肌瘤细胞的其形态学变化。结果 10-810-7mol/L 米非司酮对细胞生长无影响，10-6mol/L 以上浓度肌瘤细胞萎缩，10-4mol/L 抑制作用最强。结论 米非司酮破坏肌瘤细胞结构，干扰核膜、胞膜、细胞器、及染色体，并与米非司酮浓度成正相关。 【关键词】 体外培养;子宫肌瘤细胞;米非司酮;形态学【Abstract】 Objective To observe the morphological changes of the human leiomyoma cells cultured in the presence of mifepristone,and to explore the optimal concentration of treating leiomyoma with mifepristone.Methods The morphological changes of the cells were observed under microscope and electron microscope.Results The inhibitory effect of mifepristone on the cells was only expressed when the concentration of mifepristone was relatively high (10-6mol/L),and the cell began to regression.Conclusion Mifepristione may destroy the struture of leiomyoma cells and interfere the membrane of cell and nuclei,organs of cell,chromosome. The inhibitory effect of mifepristone on human leiomyoma cells in vitro is concentrationdependent.【Key words】 culture in vitro;uterine leiomyoma;mifepristone;morphology子宫肌瘤是激素依赖性肿瘤已被公认，抗孕激素制剂米非司酮用于治疗子宫肌瘤已取得一定疗效，但肌瘤缩小程度差异较大，从 0%80%不等1，故人们对米非司酮治疗子宫肌瘤机制进行了不同层面的研究。本研究采用子宫肌瘤细胞体外培养法加入不同浓度的米非司酮，用电镜及光镜观察其结构变化，以了解米非司酮缩瘤的机制，并为临床应用米非司酮治疗子宫肌瘤时剂量的选择提供参考依据。1 材料与方法1.1 标本来源2009 年 2 至 6 月在天津市第三中心医院手术室行子宫肌瘤剥除及子宫切除 17 例患者的肌瘤组织，患者年龄 4055 岁，并且确认术前 3 个月未服用过激素类药物。根据月经周期和病理诊断确定子宫内膜分期，且组织学诊断确诊子宫肌瘤，并未发现子宫内膜有病理性改变，其中增生期 15 例，分泌期 2 例。1.2 方法1.2.1 子宫肌瘤细胞分离与原代培养:将新鲜的肌瘤组织剪碎成 1 mm3 小块，5 g 组织加入细胞生长液与细胞消化液 21 的混合液 20 ml 中消化，过目筛网除去未消化的组织，离心，得到纯化的子宫平滑肌瘤细胞。用 0.04%台盼蓝染色行活细胞计数，观察细胞活力约 90%，用细胞生长液调整细胞种植浓度为 2105/ml，混匀后接种于 24 孔培养板中，每孔接种 2 ml，置 37 5% CO2 恒温孵育箱中培养，每 23 天换液 1 次。1.2.2 米非司酮对肌瘤细胞体外生长的作用:取同批培养成单层生长至融合状态的细胞(57 d)，加入米非司酮浓度 10-810-4 mol/L,每天记录观察细胞的形态及生长情况，并及时照相。每组均设对照，对照组加入等体积无水乙醇。1.2.3 米非司酮作用后的肌瘤细胞的超微结构：用 11 的 2% 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)及 0.05%的胰蛋白酶 2 ml 加入培养 3 d 细胞的孔板中消化，离心制成细胞团， 2.5%戊二醛固定，PBS 液漂洗，10%四氧化锇后固定，乙醇逐级脱水，Epon812 环氧树脂包埋。LKBNOVE 型超薄切片机切片，厚度为 5070 nm，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，JEOL1010 透射电镜观察。2 结果2.1 米非司酮对体外培养的子宫肌瘤细胞作用的光镜下形态体外培养生长良好的子宫肌瘤细胞呈梭形、或不规则三角形，细胞呈放射状或旋涡状生长，HE 染色中央有卵圆形的核，核旁可见空泡，胞浆饱满(图 1)。10-8 10-7mol/L 的米非司酮组细胞生长未受影响(图 2)，随药物浓度增加，细胞逐渐走向死亡。10-6mol/L 时肌瘤细胞开始萎缩胞浆减少，但核的变化不大(图 3)，当药物浓度增至 10-4mol/L 细胞成圆球形，绝大多数死亡(图 4)，图 1 对照组肌瘤细胞(HE200)图 2 10-7mol/L 组肌瘤细胞(HE100)图 3 10-6mol/L 组肌瘤细胞(HE100)图 4 10-4 mol/L 组肌瘤细胞(HE100)2.2 米非司酮对体外培养的子宫肌瘤细胞作用的电镜下形态2.2.1 对照组细胞：可见清晰的细胞核及核仁，核染色质较密集，核仁较大，胞浆内细胞器部分有脂质空泡，增生的细胞膜及细胞器尚清晰，糖原颗粒尚较丰富，部分细胞形态不一(图 5)，高倍观可见核染色质，且可见分裂相。细胞膜结构及胞浆内细胞器均较活跃，细胞生长较大，内质网糖原颗粒及线粒体均较丰富，其膜结构较厚，未见明显水肿及空泡，可见伪足样结构(图 6)。图 5 对照组超微结构低倍观图 6 对照组超微结构高倍观2.2.2 10-6mol/L 米非司酮给药组：细胞呈收缩状态，细胞膜细突样改变，膜结构不清，部分膜结构溶解破坏，胞浆内可见蜕变的细胞器接膜结构。胞浆内多呈空网状结构，其中可见固缩的核仁(图 7)。高倍观：未见正常细胞核、核仁及胞浆中细胞器。胞浆呈高度空泡样变，细胞器多呈蜕变，膜结构不清。其中见部分裂解的，大小不等的染色质结构(图 8)。图 7 10-6mol/L 组超微结构低倍观图 8 10-6mol/L 组超微结构高倍观2.2.3 10-4mol/L 米非司酮给药组：可见变性水肿的细胞结构。膜结构部分不清，部分尚呈肿胀样病变，细胞核高度肿胀。部分呈溶解状态及小空泡样变(图 9)。高倍观：细胞膜结构模糊不清，部分细胞膜破坏，细胞膜及细胞核高度肿胀，核染色质固缩变形(图 10)。图 9 10-4mol/L 组超微结构低倍观图 10 10-4mol/L 组超微结构高倍观3 讨论利用子宫肌瘤体外培养进行研究可以控制混杂因素，更直观地了解活细胞的生命活动，但在体外的研究结果与活体上所得出的结论有时不一致，这是因为人工模拟的细胞生长环境与体内环境相比仍有很大差异，因此在利用培养细胞作实验时，应设计与体内环境相似的条件。原代细胞培养比传代细胞更接近体内情况，应用子宫肌瘤体外原代培养的细胞进行研究具有很高的应用价值，子宫肌瘤细胞遗传学和分子遗传学的研究是探讨子宫肌瘤发生发展的重要手段2，免疫细胞化学可以排除非肌瘤细胞的干扰，更直接观察药物作用后细胞的改变并探讨其机理，由于肌瘤是良性肿瘤且组织致密难以消化，消化酶价格较贵，国内有关肌瘤体外培养的报道较少。体外培养的子宫平滑肌瘤细胞加入米非司酮 10-810-7mol/L 培养 3 d，光镜下观察细胞生长不受限，与对照组比较无区别，当米非司酮浓度达到 10-6 mol/L 时，肌瘤细胞开始萎缩，胞浆减少，但核的变化不大，当药物浓度增至 10-4mol/L 细胞成圆球形，绝大多数死亡，这与李桂玲等3报道一致，唐福星等4对 6 例米非司酮治疗 7 d 的子宫肌瘤组织进行电镜超微结构观察也有类似发现。由此可见，米非司酮对子宫肌瘤的治疗作用是肯定的。但临床用药常用剂量为 1050 mg，即血药浓度为 10-6mol/L，治疗 3 个月，肌瘤退缩约 40%50%，当停药 3 个月后肌瘤又复发，推测为临床用药常用剂量仅能达到抑制肌瘤生长的作用，并未杀死肌瘤细胞或引起细胞凋亡，当药物作用一旦解除，肌瘤在体内重新受到性激素刺激恢复生长。另有报道，摄入量在 100800 mg 时，血药浓度不随用药量的变化而改变;无药物蓄积作用，这可能是受 1 酸性糖蛋白饱和度的影响5，后者是米非司酮在人血浆中的主要结合物质。故怎样使高浓度的米非司酮达到局部肌瘤部位还需进一步研究。【参考文献参考文献】1 陈春林, 张随学. 在体女性盆腔动脉血管网数字化三维模型构建方法及意义J. 中国实用妇科与产科杂志. /yxyy/main/index.php.2011(04) 2 徐玉静,欧阳振波,刘萍,陈春林. 磁共振成像在子宫肌瘤动脉栓塞术中的应用价值J. 中国实用妇科与产科杂志. 2011(04) 3 方驰华,苏仲和. 数字医学技术在胰腺肿瘤诊断和可切除性评估中的研究J. 实用医学杂志. /xyfm/class/. 2010(10) 4 欧阳振波,刘萍,余艳红. 女性骨盆研究进展及意义J. 中国实用妇科与产科杂志. /chuanmei/class/.2010(02) 5 刘萍,余艳红,陈春林,欧阳振波,宋小磊,王宏琢,昌仁民,王建平. CT 扫描计算机三维重建女性骨盆的研究方法和应用J. 中国实用妇科与产科杂志. 2010(01) 6 欧阳振波,张随学,刘萍,陈春林,唐雷,李泽宇,黄睿,钟光明,梁波,全显跃,刘畅,钟世镇. 宫颈癌子宫动脉血管网模型的构建及其三维可视化研究J. 中国临床解剖学杂志. 2009(06) 7 吴龙,周义军,高劲松,孙建永,李玉飞,马俊,金科. 女性盆腔的 MRI 三维重建J. 第四军医大学学报. /qikan/class/. 2009(12) 8 张绍祥. 数字化人体与数字医学的研究概况及发展趋势J. 第三军医大学学报. /.2009(01) 9 高成杰, 张随学,裴强,徐达传. 成人盆腔血管多层螺旋 CT 三维重建初步研究J. 中国临床解剖学杂志. 2006(01) 10 单锦露,张绍祥,刘正津,谭立文,林支付,唐泽圣. 中国数字化可视人女性盆腔的计算机三维重建J. 解剖学杂志. 2005(03) 11 续靖宁,邓晓红. 子痫前期患者血清游离脂肪酸浓度测定的临床意义J. 右江医学. 2009(02) 12 刘增佑,朱艳宾,王淼,崔艳双, 张随学,胡群英. 巨噬细胞集落刺激因子与妊娠期高血压疾病相关性的初步探讨J. 中国妇幼保健. 2010(31) 13 佟艳,张晶,钱荣华,李蕊. 血清钙水平与妊娠期高血压疾病的关系分析J. 河北医药. /news/class/.2010(24) 14 林丽珍,杨茵. 妊娠期高血压疾病的临床预测研究进展J. 中国优生与遗传杂志. 2010(11) 15 狄海红. 妊娠期高血压疾病子痫前期对胎儿的影响J. 临床医学. 2011(09) 16 张随学,杨彦,杨伟文. 可溶性细胞间粘附分子-1 在妊娠期高血压疾病中的作用J. 中国妇幼保健. /news/class/. 2007(09) 17 马丽,叶新红,张文静. 311 例妊娠期高血