东方百合杂交后代SRAP鉴定.doc

本科毕业设计（论文）本科毕业设计（论文） 题题 目：目：东方百合杂交后代东方百合杂交后代 srapsrap 鉴定鉴定 学学 院：院： 森林资源与环境学院森林资源与环境学院 专专 业：业： 生物技术生物技术 学学 号：号： 学生姓名：学生姓名： 指导教师：指导教师： 职职 称：称： i 东方百合杂交后代东方百合杂交后代 srapsrap 鉴定鉴定 摘要摘要：为探讨东方百合杂交后代与亲本间的亲缘关系,本研究选用了 46 对 srap (sequence- related amplified polymorphism)标记引物对东方百合 constanta和sorbonne以 及 30 份constanta sorbonne的 f1代基因组 dna 进行遗传多样性以及遗传关系分析。 共检测到 140 个多态性标记位点，平均每对引物组合产生 3.1 个多态性位点，其中不同引 物组合扩展条带大小集中在 100 到 1100bp 之间。应用 ntsys-pc (version 2.1)软件采用 平均距离法(upgma)进行聚类分析。结果表明， constanta和sorbonne以及其杂交子代间 的相关系数为 0.4800.672，其中sorbonne和 8 号供试材料的亲缘关系最近。upgma 聚 类将 32 个供试材料分成 2 类，较好的反应了其亲缘关系。聚类分析结果与形态分类结果 大致吻合。srap 标记适合于百合属植物遗传多样性与遗传关系分析。本研究为百合杂交 后代真实性鉴定提供了 dna 分子证据，从而提高选育效率，降低育种成本。 关键词关键词:东方百合;杂交后代;srap;遗传关系 ii genetic diversity of oriental lily hybrid offspring using srap markers abstract to probe the hybrids and their parents relationship of oriental lily, 45 sequence-related amplified polymorphism (srap) primer combinations were chosen to analyze genetic diversity of constanta and sorbonne and 33 f1 hybrids of constanta sorbonne. 140 polymorphism loci were produced and the average number of polymorphic loci were 3.1per primer pairs.primer combinations of different bands in 100 on size expanded to 1100bp. dendrograms were constructed by the unweighted pair group method of arithmetic average (upgma) using the ntsys-pc version 2.1. the result showed the genetic similarity coefficient of constanta and sorbonne and 30 f1 hybrids of constanta sorbonne ranged from 0.480 to 0.672.among them sorbonne dan 8 of the materials closest relative. 32 materials were classified into 2 clustering groups by upgma, the result quite shows their linage relationship. clustering analysis results and the shape classification results roughly identical. srap mark suitable for the lily family genetic diversity and genetic relationship analysis.this research will provid evidence of dna molecules for identification of lily hybrids, improve breeding efficiency and reduce the cost of breeding. key words: oriental lily; hybrid; srap; genetic relationship iii 目目 录录 前言前言 1 1 文献综述.2 1.1 遗传标记及其应用2 1.1.1 形态标记2 1.1.2 细胞标记2 1.1.3 生化标记2 1.1.4 分子标记2 1.2 常用分子表及类型3 1.2.1 限制性片段长度多态性（rflp）.3 1.2.2 随机扩增多态性 dna（rapd）3 1.2.3 简单重复序列（ssr）.4 1.2.4 扩增片段长度多态性（aflp） 4 1.2.5 简单重复序列间扩增多态性（issr）4 1.2.6 序列相关扩增性（srap）4 1.3 常用分子标记 rflp、rapd、ssr、aflp、issr、srap .5 1.4 dna 分子标记在花卉研究中的应用及进展 6 1.4.1 种质资源鉴定6 1.4.2 遗传多样性研究6 1.4.3 亲缘关系及分类研究6 1.5 花卉分子育种中应注意的问题7 2 材料与方法.7 2.1 实验材料7 2.2 试验方法8 2.2.1 基因组 dna 提取 8 2.2.2 pcr 体系及扩增8 2.2.3 数据统计8 3 结果与分析.9 3.1 srap 扩增结果及多态性条带分析.9 3.2 遗传多样性分析9 4 讨论与展望.10 致谢致谢 12 参考文献参考文献 13 1 前言 百合(lilium.l.)是百合科（liliaceae）百合属(lilium)植物所有种的总称，为多年生草 本球根花卉1。百合是世界五大鲜切花之一，其花朵硕大、花色艳丽、花姿百态、芳香宜 人，被世界各地广为栽培，在世界鲜切花市场中占有十分重要的地位。目前，荷兰和美 国成为世界百合的培育中心，已培育出数以千计的品种，几乎垄断了国际百合种球市场。 我国的百合鲜切花生产，种球几乎完全依赖进口，进口的种球种性退化快，严重制约着 我国百合鲜切花产业化的发展。 中国是百合属植物自然分布中心，全世界百合约有 97 个种，而起源于我国的就有 47 个种和 18 个变种，约占世界百合属植物的一半，其中有 36 个种和 15 个变种为中国特有 种2。中国的百合种质源于 18 世纪后期开始相继传入欧洲，对世界百合育种做出了极大 的贡献。中国百合资源不仅是我国的宝贵财富，也是世界花卉种质资源库中的宝贵财富3。 利用我国丰富的百合资源，采用生物技术与常规育种相结合，培育出拥有自主知识产权 的百合新品种，这对改变我国在百合产业上依赖进口品种的被动局面，提高我国花卉业 在国际市场种的竞争力，具有十分重要的意义。 针对以上问题，我国早在 20 世纪 80 年代初，黄济明就率先进行百合的杂交育种工 作，90 年代以来，杂交育种研究持续不断，当时的杂交以野生百合间的杂交为主，后因 工作中断，并没有培育出有市场潜力的品种4。近年来，随着国内百合市场的持续升温， 从事百合育种的科研院所也在增多。目前，在百合资源收集和种质创新方面开展工作较 多的单位主要包括北京农科院、北京林业大学、南京林业大学、西北农林科技大学、云 南省农科院等，但在百合育种的基础理论方面的研究则相对较少。 从 2002 年开始,本实验室较为系统的收集整理了我国野生百合资源及代表性商品种。 已收集了野生百合 35 个种，1000 多份；采用细胞工程及田间保存相结合的方法，共计保 存了 21 个种 45 个种源的 300 多份种质。收集商品种 30 个，其中东方百合 15 个，亚洲 百合 11 个，麝香百合 4 个；建立了野生百合及部分商品种的组培产业化生产技术体系； 运用花粉形态形状、issr 分子标记、its 序列、叶绿体 trnl-f 区序列分别研究收集种质 资源的亲缘关系5-9；2004 年-2008 年连续 5 年开展百合的杂交育种及胚拯救研究，获得 了一大批远缘杂交种后代，筛选出了少数有潜力的新品系。但在研究过程中发现，百合 为多年生草本花卉，东方百合杂交种后代开花需要 3 年以上时间，使得新品系的选育过 程漫长。因此，缩短育种周期，提高选育效率，从理论上探索百合分子标记辅助育种 （marker assistant selection,mas）的分子基础显得尤为重要。 2 1 文献综述 1.1 遗传标记及其应用 遗传学上通常将生物体中可识别的染色体或染色体的一段等位基因或在家系中传递 的任何一种遗传特性等称为遗传标记(genetic markers)。经典遗传学中是以形态标记和细 胞学标记为基础的。20 世纪末，由于遗传学在基因定位、遗传作图、基因组研究及群体 遗传学与进化遗传学等领域的扩展与应用，经典的、基于表型的形态学、细胞学水平上 的遗传标记已经远远不能满足要求，一批新型的遗传标记，如蛋白质标记、同工酶标记、 dna 标记等分子标记被开发利用10-13。当前遗传标记主要有 4 种类型： 1.1.1 形态标记 即植物的外部特征特性，如株高、根粗、穗长、粒色、生物学产量等。在众多的遗 传标记中，形态学标记的应用历史最为悠久。孟德尔正是利用豌豆 7 对单基因控制的形 态性状进行研究，并建立了著名的分离规律和自由组合规律。形态标记简单直观，但其 标记数有限、多态性很差、易受环境条件影响。因而其在应用上极其有限。 1.1.2 细胞标记 染色体畸变如倒位、移位等使得染色体数目及结构的变化常常引起表型的变化，因 此染色体的变化可以作为一种细胞学的遗传标记。细胞学标记主要是染色体核型(染色体 数目、大小、着丝点位置等)和带型。显然这些标记的数目也很有限。 1.1.3 生化标记 主要包括同工酶和贮藏蛋白，其标记数亦有限，不能满足种质资源鉴定和育种工作 的需要。 1.1.4 分子标记 是一种新的理想的遗传标记形式。分子标记辅助选择(molecular marker-asslsted selection，简称 mas)是现代分子生物学与传统遗传育种的结合点，借助分子标记可以对 育种材料从 dna 水平上进行选择，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改 良。它有以下优点：(1)在植物体的各个组织、各发育阶段均可检测到，不受外界环境限 3 制，不存在表达与否的问题；(2)多态性高；(3)数量极多，遍布整个基因组。目前，分子 标记已广泛应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位、起源进化研究和标记 辅助选择育种等方面。分子标记育种需要以下技术的支撑：(1)多态性高的分子标记绘制 的遗传图谱；(2)高效自动化技术；(3)与目标农艺性状基因紧密连锁的经济有效的分子标 记。生物在长期进化过程中产生了许多由 dna 碱基序列变异所致的遗传变异。以物种内 这种极为丰富的 dna 碱基序列变异为基础发展起来的分子标记技术已相继出现几十种， 它们各具特色，为不同的研究提供了丰富的技术手段。但是分子标记育种技术目前尚不 完善和成熟，其不能作为一种育种方法单独使用，应将分子标记育种技术与常规育种技 术相结合14-16。目前，常用的 dna 分子标记有 rapd、rflp、aflp、ssr、issr、snp 和 srap 等。 1.2 常用分子表及类型 1.2.1 限制性片段长度多态性（rflp） 是发展最早的分子标记技术。是利用放射性同位素(通常用 p32)或非放射性物质(如地 高辛等)标记探针，与转移于支持膜上的总基因组 dna(经限制性内切酶消化)杂交，通过 显示限制性酶切片段的大小，来检测不同遗传位点等位变异(多态性)的一种技术。用作 rflp 的探针有 cdna 探针(即互补 dna，用 nka 作模板通过反转录合成的 dna)与基因 组 dna(gdna)探针两种。cdna 探针的保守性较强，许多禾本科植物(如小麦、水稻、玉 米、甘蔗等)的 cdna 探针都可以通用，因此这类探针是研究植物起源演化的较好探针。 但是这类探针检测的多态性频率较低，在育种上应用可能会较少。cdna 探针是从植物总 基因组 dna 中克隆出来的，这类探针检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。 rflp 标记具有共显性的特点，它可以区别纯合基因型和杂合基因型，能够提供单个位点 上的较完整的资料。rflp 的探针极多，目前各种主要作物上筛选的探针均有数千个，因 而它检测的遗传位点也非常之多。rflp 标记主要应用于各种植物遗传连锁图的绘制和目 标基因的标记。但是 rflp 标记对 dna 的需要量较大，需要的仪器设备较多，技术也较 为复杂。 1.2.2 随机扩增多态性 dna（rapd） 是以基因组 dna 为模板，以一个随机的寡核昔酸序列(通常为 10 个碱基对)作引物通 过 pcr 扩增反应，产生不连续的 dna 产物，用以检测 dna 序列的多态性。该方法的优 点主要是简单易行、需要的 dna 量极少、无放射性、实验设备简单、周期短，因此受到 研究者的普遍欢迎。目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标性状基因的标记 等研究上，也有人利用 rapd 标记来绘制遗传连锁图。该方法的缺点主要有两点:其一是 4 多数位点的标记带表现为显性的特点，因此不能提供完整的遗传信息；更主要的是该方 法在一些植物上扩增效果的稳定性和重复性较差。 1.2.3 简单重复序列（ssr） 在人类及动植物的基因组中，均存在着许多由 1-4 个碱基对组成的简单重复序列，如 (ca)n，(ac)n，(caa)n(其中 n 为重复次数)等。在植物中，akkyaa 等(1992)和 mogrnaet 等(1993)发现 at 重复较 ac 重复更为普遍。在人类基因组中，这些重复序列分布遍及所 有的染色体及染色体的各个区段，在植物上也很可能如此。目前 ssr 标记已被广泛用于 资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。与 rflp 标记相比，ssr 检测的 多态性频率要高很多。ssr 除用作探针外，还可通过 pcr 扩增植物基因组中所含的重复 序列区域，因此它具有其它 pcr 方法所不具备的优点。但是要克隆足够数量的 ssr，并 对其进行测序和设计引物，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的。 1.2.4 扩增片段长度多态性（aflp） aflp 是 1992 年由荷兰 kyegene 公司科学家 zbaeuamare 和 vospieetr 等人发明的一 项技术。其基本原理是选择性扩增基因组 dna 的酶切片段。由于不同材料的 dna 的酶 切片段存在差异，因而便产生了扩增产物的多态性。由此可见，aflp 实际是 rflp 与 pcr 相结合的一种产物。aflp 标记的多态性强，非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分 类研究。该项技术的另一个特点是稳定性、重复性强，不受环境影响，而且还具有 dna 用量少，灵敏度高、快速高效等优点；但存在操作复杂，价格较高的问题。 1.2.5 简单重复序列间扩增多态性（issr） 是一种新型分子标记，其原理是根据 ssr 的特点，采用锚定 ssr 策略，对简单重复 序列间的遗传信息进行多态性扩增的分子标记技术。由 ziekiewicz 等(1994)提出锚定 ssr 的新策略，采用锚定的微卫星 dna 为引物，即在 ssr 序列的 3，端或 5，端加上 1-4 个 简并碱基，每个简并碱基代表 2-3 个碱基，优点是在基因组上只有那些与锚定的核昔酸匹 配的位点才能被靶定，避免 ssr 在基因组的滑动，大大提高了 pcr 扩增的专一性。所研 究生物系统的基因频率及方差、基因的多寡及分布，是揭示遗传多样性及差异的基本遗 传参数，是反映遗传结构的主要量值。dna 水平的遗传多态性本质是核昔酸序列的差异， 分子标记是 dna 序列信息的间接反应，借助于标记谱带及多态性谱带，估算指纹图谱隐 含的基因频率与差异，通过计算机软件对种内遗传变异丰富程度和遗传结构、种间遗传 距离、群体间分化进行分析。 5 1.2.6 序列相关扩增性（srap） srap 是一种基于 pcr 的新型标记，由美国加州大学作物系 li 和 quiros 博士提出的。 srap 技术是与 rapd 技术相似的一种标记技术，即 srap 可用一对引物，但所用的引物 是在 ssr 的基础上设计的。srap 技术是一种无需任何序列信息即可直接 pcr 扩增的新 型分子标记技术。srap 标记已在水稻、棉花、番茄、马铃薯、柑橘、大蒜、辣椒、黄瓜、 芹菜、油菜、拟南芥、小麦等植物研究中得到成功应用,具有简便、中等产量、高共显性、 重复性、易于分离条带及测序等优点,在基因组中分布均匀，适合基因定位、基因克隆、 遗传图谱构建等生物学研究。在 srap 分子标记中引物的设计是关键, 它利用独特的引 物设计对 orfs ( open reading frames, 开放式阅读框)进行扩增。正向引物长 17 bp 5端的 前 10 bp 是一段非特异性的填充序列, 紧接着是 ccgg, 它们一起组成核心序列, 然后是 靠着 3端的 3 个选择性碱基, 对外显子进行扩增。反向引物长 18 bp, 即由 5的 11 个无 特异性的填充序列和紧接着的 aatt 组成的核心序列, 及 3的 3 个选择性碱基, 对内含 子和启动子区域进行特异扩增； 因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等 而产生多态性扩增产物。 1.3 常用分子标记 rflp、rapd、ssr、aflp、issr、srap 尽管 rflp、rapd、ssr、issr 和 aflps 种分子标记在植物辅助育种、遗传图谱构 建、数量性状基因位点作图及种质资源遗传多样性研究上得到了广泛的应用，但它们在 实际应用上仍有各自的特点。如 rflp 对 dna 多态性检出的灵敏度不高，rflp 连锁图 上常常存在许多大的空间区，且操作繁琐，有放射性危害；rapd 存在稳定性和重复性较 差等问题，只能检测到等位基因的有无，无法鉴别纯合子和杂合子的差异；ssr 必需预 先知道微卫星两翼序列信息才能设计引物，许多物种需要构建文库，而且研制开发引物 需要几个月的时间；aflp 也存在操作步骤复杂、繁琐，对仪器设备和操作程序的要求都 很高、费用也较高等问题；srap 其原理是利用基因外显子里 g、c 含量丰富，而启动子 和内含子里 a、t 含量丰富的特点设计一对独特的引物，对开放阅读框架进行扩增。相关 序列扩增多态性( srap) 是一种新型的基于 pcr 的标记系统, 是由美国加州大学蔬菜系 li 与 quiros 博士17于 2001 年在芸薹属植物开发出来, 又叫基于序列扩增多态性- sbap。引物设计是它的核心, srap- pcr 反应体系中使用两个引物:即 17 个碱基的正向 引物和 18 个碱基的反向引物。正向引物的 ccgg 和反向引物的 aatt 的核心序列使得 srap 标记主要是对基因组的开放阅读框(orf)区域进行扩增。srap 标记是基于 pcr 的标记系统, 具有操作简便快速、成本低、无放射性污染等优点。由于在设计引物时正反 引物分别是针对序列相对保守的外显子与变异大的内含子、启动子与间隔序列, 因此, 多 数 srap 标记在基因组中分布是均匀的, orfs 是基因的重要组成部分, 基因的多样性有 利于揭示遗传资源的多样性。而且 srap 引物设计可节省实验费用, 通过改变 srap 引 6 物 3端的选择性碱基可以设计多种引物, 上游引物和下游引物的自由组合, 从而可以在 较少的引物数中进行多种组合, 大大降低了引物合成成本, 提高了引物使用效率。srap 作为一种新的标记技术已成功构建了了芸薹、烤烟、棉花、黄瓜、甘薯等的遗传连锁图 谱, 其分子标记在大田作物研究的各个方面都有应用。此技术具有简单、高效、高共显性、 重复性高、易测序等优点，适合于基因的定位与克隆等分子生物学的研究。 1.4 dna 分子标记在花卉研究中的应用及进展 1.4.1 种质资源鉴定 长期以来，各种花卉异地相互引种栽培，杂交及突变，品种名和品种分类十分混乱。 因此，对现有花卉品种准确的鉴定和分析十分重要，而分子标记技术为品种鉴定提供了 新手段。ballard18等对 22 个月季的栽培品种进行了 rflp 和 rapd 分析，鉴定出其中的 20 个月季品种，结果表明，所有以抗病和感病为亲本的 4 倍体月季品种表现出较高的遗 传多态性，所以抗病和感病的杂交后代适合遗传图谱的建立。明军19等利用梅花 aflp 多态位点信息，从 178 个梅花品种及近缘（品）种构成的群体中，选取了 52 个品种样品 进行了梅花品种资源核心种质的构建。 于燕莉20采用 rapd 标记方法对金银花中的大毛花金银花、鸡爪花金银花品系进行 鉴定，使用 35 个随机引物进行扩增实验，结果大毛花金银花共扩增 dna 谱带 24 条；鸡 爪花金银花共扩增 dna 谱带 26 条，从而区分 2 个形态极为相似的品系。 1.4.2 遗传多样性研究 保护生物多样性已成为国际热点问题，其核心内容是遗传多样性的保护。遗传多样 性主要是指种内不同居群之间或同一居群不同个体之间的遗传变异的总和。遗传多样性 会反映在 dna 水平上，因此近年来，dna 分子标记被广泛地应用于植物遗传多样性和 遗传结构的研究中。石胜友21用 8 对引物对变叶海棠 30 个不同的变异类型进行了 aflp 分析，从 dna 水平上探明了变叶海棠的遗传多样性是变叶海棠与陇东海棠和花叶海棠产 生渗入杂交形成的。侯小改利用荧光标记 aflp 技术对 30 份牡丹栽培品种进行了总基因 组 dna 水平上的多态性检测，结果共获得 1123 条可统计的条带，其中 965 条呈多态性， 多态性带百分率达 86%，揭示了牡丹栽培种质丰富的遗传多样性。田晔林22用 rapd 分 子标记技术分析 8 个一串红品种 dna 的多态性，30 个引物扩增出 162 条 dna 谱带， 119 条是多态性的，多态性占 73.5%，这表明了 rapd 技术是检测一串红品种遗传多样性 的有效工具，并为优良品种的遗传改良提供了选配育种亲本的依据。 7 1.4.3 亲缘关系及分类研究 应用分子标记进行植物的分类及亲缘关系分析，可以在分子水平上阐明生物系统演 化及分类情况，也直接关系到育种亲本的选配和种质资源的合理有效利用。王献23利用 aflp 来研究紫薇的亲缘关系，结果表明，矮生品种间的亲缘关系较近，他们中的粉润和 矮生垂枝粉的关系最近；具有优异性状的品种白蝶飞舞和层云积雪的关系较近，红蝶飞 舞和蓝色妖姬的关系也较近，而与白密香的关系较远；2 个普通的白花品种紫爪银薇和白 云映霞的关系较近。2000 年，周春玲24利用 aflp 技术，对菊属植物 12 个分类群的亲缘 关系进行分析，结果表明，所选的 2 个栽培品种滁菊和亳菊可归并为一个品种，该品种 与毛华菊、野菊、甘菊亲缘关系相对较近，与紫花野菊的亲缘关系次之，而与小红菊的 亲缘关系相对最远。张俊祥采用 aflp 技术对云南省兰属的 14 个种和 3 个变种中的 38 份 样本进行了亲缘关系分析，16 对 aflp 引物扩增的条带聚类结果表明，云南省国兰遗传 多样性非常广泛，相同品种间的不同个体扩增出的条带模式相差很大。刘小莉25对报春 花属 10 个种的种间变异进行了 issr 分析，将这 10 个种明显地聚为了三大类。林丽美26 用 rapd 技术对百合属的 4 种商品药材百合进行了鉴定。赵喜华27对 11 种杜鹃属植物 进行了 rapd 分析，基于 dna 分子水平探讨了杜鹃属植物种间的亲缘关系和系统位置。 于恒秀28利用 issr 引物鉴定芍药栽培品种间的亲缘关系。苏雪29应用 rapd 技术对甘 肃栽培的 16 种紫斑牡丹品种的分类进行了初步研究。 1.5 花卉分子育种中应注意的问题 花卉分子育种应把目的基因的开发利用与花卉基因文库的保存紧密地结合起来，保 护花卉遗传资源的多样性，防止因分子育种加剧花卉资源遗传的均一性。以基因工程技 术为主导的分子育种技术与传统育种方法各有所长，因此花卉分子育种与传统育种方法 必须紧密结合，充分发挥两者的长处，以便加速新奇花卉品种选育的进程。如可以将外 源目的基因通过基因工程手段先导入少数优良品种中，然后再通过杂交育种方法将目的 基因导入其它品种或亲缘关系较近花卉中，进而扩大育种规模。我国花卉分子育种进展 较慢，而欧美一些国家进展很快，为了加快我国花卉分子育种的步伐，我们应加强国际 合作，借鉴他们已有的研究成果，少走弯路。花卉分子育种需要植物学、植物栽培学、 分子生物学、细胞遗传学、分子遗传学、数量遗传学、植物化学、生物化学等多学科共 同协作才可更好地完成，因此应加强部门、行业、学科间的交流与合作。 8 2 材料与方法 2.1 实验材料 本实验于 2012 年 3 月5 月在南京林业大学进行。供试的东方百合及其杂交后代均来 自南京林业大学林木遗传育种实验室百合试验田。取幼嫩叶片低温带回实验室，液氮冷 冻后-70保存备用。 2.2 试验方法 2.2.1 基因组 dna 提取 采用改良的 catb 法提取 dna，去 rna 后调整 dna 浓度至 40 ng/l，-70保存 备用。琼脂糖凝胶电泳检测 dna 质量和完整性；核酸蛋白分析仪检测 dna 浓度。 2.2.2 pcr 体系及扩增 选取了 46(引物序列如表 1 所示)对多态性高，重复性好的的引物，用于 pcr 扩增(如 图 1)。此次 pcr 扩增反应选取的是 10l 的反应体系。其中，ddh2o 3.35l，buffer1l，mg2+1l，dntp0.3l，上、下游引物各 1.6l，taq0.15l 以及 1l 样本 dna。扩增程序为：94预变性 8 分钟，94变性 1 分钟，35复性 1 分钟， 72延伸 1 分 30 秒，5 个循环，94变性 1 分钟，59.3复性 1 分钟，71延伸 1 分 30 秒，30 个循环，72延伸 8 分钟。4保存。扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 表1 srap分子标记引物名称及序列 tab. 1primers and their sequence of srap 正向引物 名称 引物碱基序列 反向引物 名称 引物碱基序列 me1tga gtc caa acc ggt aaem1gac tgc gta cga att aat me2tga gtc caa acc ggt ccem2gac tgc gta cga att ctg me3tga gtc caa acc gga caem3gac tgc gta cga attcga me4tga gtc caa acc gga ctem4gac tgc gta cga att atg me5tga gtc caa acc gga ggem5gac tgc gta cga att cca me6tga gtc caa acc gga acem6gac tgc gta cga att tag me7tga gtc caa acc gga cgem7gac tgc gta cga attgag me8tga gtc caa acc gga gaem8gac tgc gta cga att gcc me9tga gtc caa acc ggt tgem9gac tgc gta cga att tca 9 me10tga gtc caa acc ggt gtem10gac tgc gta cga att cat 2.2.3 数据统计 研究采用引物名称加片段大小的方式对作图所用的 issr 和 srap 标记所扩增的条带 进行命名，如 me1em3-260 指用 srap 引物 me1em3 扩增出的片段长度为 260bp 的扩增 带，对获得的 dna 条带进行统计，在相同迁移位置，清晰条带记为 1，模糊或无条带 图 1 srap 引物 me1em6 对部分 f1代个体的扩增结果 fig. 1 the results of pcr amplification use the primer of 3a01 of srap me1em6 of part of f1 individual. 表2 srap标记的扩增情况 tab.2 summary of the detection of srap markers in oriental lily 项目srap 数据 筛选出的引物数目46 扩增产物片段大小范围0.11.1kb 检测出的标记位点数140 每个引物扩增出多态性位点的平均数3.04 记为 0，建立 0、1 原始矩阵。 3 结果与分析 3.1 srap 扩增结果及多态性条带分析 选取的 46 对重复性好，多态性明显的引物对 32 份供试材料的基因组 dna 进行扩增， 扩增结果得到 140 条清晰条带，平均每对引物产生 3.04 条多态性条带。扩增产物片段大 小范围在 0.11.1kb。 10 3.2 遗传多样性分析 32 份供试材料的遗传相似系数变化范围为 0.41420.6286，相似系数均值为 0.5214。32 份材料的聚类分析（如图 2 所示） ，可以看出，东方百合杂交后代主要分为 2 个群体，一个群体和constanta的亲缘性较为密切，另一个则和sorbonne比较密切，总 体上和constanta的亲缘性较近。遗传距离在 0.4800.672 之间。 图 2 东方百合杂交后代聚类图 fig. 2 oriental lily hybrid clustering 4 讨论与展望 我国百合种间差异明显、基因资源丰富。同时也证明 srap 标记适合于百合属植物 遗传多样性分析，是一种有效、可靠的分子标记，聚类结果显示供试材料表现出一定的 地理相似性。在实验中要恪守实验室守则不得违规操作，注意实验安全，安全使用各种 实验试剂。srap 分子标记对百合的育种工作起到了很重要的作用，以基因工程技术为主 导的分子育种技术与传统育种方法各有所长，因此花卉分子育种与传统育种方法必须紧 密结合，充分发挥两者的长处，以便加速新奇花卉品种选育的进程。如可以将外源目的 基因通过基因工程手段先导入少数优良品种中，然后再通过杂交育种方法将目的基因导 入其它品种或亲缘关系较近花卉中，进而扩大育种规模。有要求才有进步，所以在试验 11 中要不断创新，大胆假设小心求证，为我国的花卉育种工作做出贡献。长期以来，形态 特征一直是百合属植物分类的主要依据。本实验的的 srap 鉴定得到的数据和已有的形 态分类结果大致吻合，为植物分类多了一种依据。本研究为百合杂交后代真实性鉴定提 供 dna 分子证据，从而提高选育效率，降低育种成本。 由于本次实验系本科毕业设计，实验数据不尽完善，如有机会将进一步做深入研究， 应用分子标记进行植物的分类及亲缘关系分析，可以在分子水平上阐明生物系统演化及 分类情况，也直接关系到育种亲本的选配和种质资源的合理有效利用。分子标记广泛存 在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较， 就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以 对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种 亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。 12 致谢 本文是在导师席梦利教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、研究方 法的确立及论文的写作，席老师均给予了精心指导，使我受益匪浅。导师深 厚的专业功底，严谨的治学态度，高效的工作作风，豁达谦虚的处世风范， 为我今后的学习生活树立了榜样，让我终生受益，在此谨向席老师表示最衷 心的感谢。 论文工作的顺利完成还得益于丁信誉师兄给予的热情帮助，从而使试验 设计方案更为完善、研究工作颇为顺利。 至此论文撰写完全完成之际，谨向所有关心、支持和帮助我的老师、同 学和朋友致以诚挚的谢意和美好的祝福！ 作者：周明杰 2012 年 5 月于南京 13 参考文献 1汪发瓒,唐进.中国植物志十四卷:百合科(一)m.1980,北京:科学出版社. 2龙雅宜,张金政.百合属植物资源的保护与利用j.植物资源与环境学报 1998,7(1):40-44. 3赵祥云,王树栋,陈新霞.百合m.2000，北京:中国农业出版社 4吴祝华,施季森,池坚,等.百合资源与育种研究进展j.南京林业大学报,2006,30(2): 113-338. 5吴祝华,施季森,席梦利,等.百合种质资源花粉形态及亲缘关系研究j.浙江林学院报, 2007,24(4): 406-412. 6邓明文,吴祝华,席梦利,等岷江百合 issr-pcr 反应体系优化j