灰毡毛忍冬花蕾总RNA的不同提取方法比较 毕业论文.doc

目录摘要 .1关键词 .1引言. .21 材料与仪器.21.1 实验材料.21.2 实验试剂.21.3 实验器材.22 总rna提取方法及电泳.32.1 sds法.32.2 ctab法.32.3 sds改进法.32.4 琼脂糖凝胶电泳.42.4.1 琼脂糖凝胶（25ml；0.8%）的制备.42.4.2 rna进行电泳.42.4.3 rna的od值测定.43 实验结果与分析. 43.1 结果.43.2 分析.44 讨论.55 参考文献.5灰毡毛忍冬花蕾总rna的不同提取方法比较 摘要：目的：通过比较三种不同的rna提取方法提取灰毡毛忍冬花蕾总rna，选取最佳提取方法提取高质量总rna,以满足后续基因克隆实验。方法：以灰毡毛忍冬花蕾为实验材料，分别采用sds法、ctab法、sds改进法提取总rna，并采用紫外及琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测rna纯度及完整性。结果：sds改进法提取效果最佳，od值最接近标准，电泳条带清晰，sds法od值偏小，rna条带清晰，ctab法提取的总rna出现降解现象。结论：这三种方法的提取结果不能满足灰毡毛忍冬花蕾总rna的后续试验。关键词：灰毡毛忍冬； 花蕾； 总rna； sds法； ctab法； lonicera macranthoides hand.-mazz.buds of honeysuckle comparing different extracting method of total rnaabstract objective： by comparing three different types of rna extraction method to extract lonicera macranthoides hand.-mazz. total rna, selecting the best extraction method to extract high quality total rna and subsequent gene cloning experiments. methods: lonicera macranthoides hand.-mazz.buds of honeysuckle as experimental material,the sds method, ctab method and sds were used respectively to improve method of extracting total rna, and adopts the method of uv and agarose gel electrophoresis to detect rna purity and integrity. result: sds improved method of extracting effect is best, od value closest to standard, electrophoresis stripe is clear, od value small sds method, rna the stripe is clear, ctab method to extract total rna degradation occurs. conclusion: the three methods of extraction result cant satisfy lonicera macranthoides hand.-mazz.buds of honeysuckle total rna of the follow-up test.key words flower bud； total rna； sds method； ctab method；引言： 灰毡毛忍冬（lonicera macranthoides hand.-mazz）系忍冬科（caprifoliaceae）忍冬属（lonicera）植物，产安徽南部、浙江、江西、福建西北部、湖北西南部、湖南南部至西部、广东(翁源)、广西东北部、四川东南部及贵州东部和西北部，花蕾灰绿色或棕黄色，疏生毡毛1，别名山银花，具有清热解毒，疏散风热的功效，用于痈肿疗疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温热发病等，也可作为提取绿原酸或挥发油的原料，广泛用于制药、香料、化妆品、保健食品、保健饮料等领域，具有很高的经济价值。国内近年来对于灰毡毛忍冬及其变异品种繁殖的相关研究越来越多，汪治等2详细介绍了湘蕾金银花的嫁接技术，繁殖方法和栽培管理技术；张雪等3对灰毡毛忍冬扦插繁殖过程中生营养物质含量变化进行了研究;税丕先等4按照gap的要求对灰毡毛忍冬开展了规范化种植研究。从分子水平对其进行研究有李萍、蔡朝晖5用pcr分析技术应用5srrna基因间区序列变异对道地性金银花和灰毡毛忍冬进行了研究初探， 结果表明lonicera属植物5srrna基因间区约210 bp，其中g十c含量较高，达70左右，不同居群金银花或山银花碱基序列有差别，存在遗传差异；汪治等6对灰毡毛忍冬的染色体和核型进行了分析；李俊彬，王晓明7开展过灰毡毛忍冬dna不同提取方法的比较实验；周日宝、王珊等8-9对灰毡毛的种质资源进行了issr分析；陈大霞等10以15个不同来源地的野生灰毡毛忍冬及2个花蕾型栽培品种为实验材料，通过srap分析，揭示出灰毡毛忍冬存在着丰富的遗传多样性。但在灰毡毛忍冬dna序列测定及序列分析方面国内外还没有相关报道。为使灰毡毛忍冬更好的得到开发和利用，以花蕾为实验材料，比较了花蕾总rna提取的不同方法。1 材料与仪器1.1 实验材料 本次试验采用的样品为2012年采摘于湖南省隆回县金银花栽培基地，由湖南中医药大学周日宝教授鉴定为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬。 1.2 实验试剂 液氮; -巯基乙醇; 无水乙醇; 3mol/l的kac; 氯仿; 水饱和酚; 异丙醇; depc处理水; 75%乙醇; licl; 苯酚; sste溶液（100ml需nacl 5.844g; 5%sds 10ml; 1m tris-hcl（ph=8.0）1ml; 0.25m edta（ph=8.0） 400l); 2%sds提取液（100ml需sds 2g; pvp 2g; 1m tris-hcl（ph=8.0）10ml; 0.25m edta （ph=8.0）10ml ); ctab提取液（10ml需ctab 0.2g; nacl 2.3376g; 0.25m edta（ph=8.0）2ml; 1m tris-hcl（ph=8.0）2ml); 5tbe（1000ml需tris碱54g; 硼酸2.75g; 0.25m edta（ph=8.0）4ml; 超纯水定容至1000ml） 1.3 实验器材 2.0ml离心管; tip头; 移液枪; 冷冻离心机; 研钵; 镊子; 螺口小白瓶; 立式压力蒸汽灭菌器; 量筒; 烧杯; 橡胶手套; 天平; 核算蛋白测定仪; 电泳仪; 微波炉; 超声波清洗器; 口罩. 2 总rna提取方法及电泳2.1 sds法 本方法是参照王暑辉11的sds法进行提取。步骤如下： 称取花蕾样品0.15g，在液氮中迅速研磨成粉末状，迅速转移至2.0ml离心管中；向上述离心管中加入600l sds提取液和40l -巯基乙醇，混合均匀，加入150ul无水乙醇和150l 3mol/l的kac，混合均匀；4，1.2万r/min下离心15min，取上清液；加入250l 水饱和酚和250l 氯仿，混合均匀，冰上放置10min；4，1.2万r/min下离心15min，取上清液；加入等体积的氯仿，混合均匀，冰上放置10min，4，1.2万r/min下离心15min，取上清液；加入等体积的异丙醇，混合均匀，冰上放置10min，4，1.2万r/min下离心15min；弃上清，加入75%乙醇1ml，温和洗涤沉淀，4，1.2万r/min下离心15min，弃上清；干燥后，用50l depc处理水溶解rna，电泳，测od值。2.2 ctab法 在2.0ml离心管中加入600l 2ctab提取液和15l -巯基乙醇，65水浴15min；取样品0.2g左右，在液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中；室温下1.2万r/min离心10min，吸取上清液于离心管中，每管中加入等体积氯仿，混合均匀，室温下1.2万r/min离心10min；吸取上清液于新离心管中，加入1/4体积的8mol/l的licl，混匀，4沉淀过夜；4，1.2万r/min离心15min，收集沉淀，用500l sste溶解沉淀，洗去dna及其他杂质；加入等体积的酚/氯仿（1:1），漩涡混匀，1.2万r/min，4离心10min，再加入等体积的酚/氯仿（1:1），漩涡混匀，同样条件下离心，洗去上清，加入1/10体积的3mol/l的nacl和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70沉淀30min；4，1.2万r/min离心20min，弃上清，用200l 70%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶于50ldepc处理水中。2.3 sds改进法 （本方法采用了sds法与试剂盒的结合，以sds法为主，利用了试剂盒rk 145的去蛋白液、漂洗液、rnase-free dd h2o及吸附柱。）取样品0.15g，将样品在液氮中迅速研磨成粉末，迅速转移至1.5ml离心管中，迅速加入1000l sds提取液和40l -巯基乙醇，混匀后，再加入150l无水乙醇和150l 3mol/l的kac，混匀，在4，1.2万r/min离心15min，取上清液；加入250l水饱和酚和250l 氯仿，混匀，冰上放置10min，4，1.2万r/min离心15min，取上清；装在新的离心管中，加入等体积的氯仿，装入吸附柱cr3中，4，1.2万r/min离心30s，弃掉收集管中的废液，向吸附柱cr3中加入500l去蛋白液rd，4，1.2万r/min离心30s，弃废液，再向吸附柱cr3中加入600ul漂洗液rw，室温静置2min，4，1.2万r/min离心30s，弃废液；向吸附柱cr3中加入500l ，4，1.2万r/min离心30s，弃废液，将吸附柱放入2ml收集管中，4，1.2万r/min离心2min，去残余液体，离心后将吸附柱cr3在室温下静置片刻，充分晾干；在放入新的离心管中，加入50l rnase-free dd h2o，室温放置2min，4，1.2万r/min离心2min，-80保存。2.4 琼脂糖凝胶电泳2.4.1 琼脂糖凝胶（25ml；0.8%）的制备取0.24g琼脂糖粉加入装有25ml 0.5tbe缓冲液的100ml锥形瓶，在微波炉中加热至沸腾，立即取出锥形瓶，边振摇变冷却至50-60，再放入微波炉中加热，重复以上操作，直至琼脂糖完全溶解，加入12.5l 10g/ml的eb，使其终浓度为0.5g/ml，充分混匀，铺板，冷却。2.4.2 rna进行电泳取上样缓冲液1l和提取的rna 5l ，在塑料手套上用移液混匀，在将上样液垂直加入到点样孔，记录加入顺序；调整电压至100v，时间为30min，使rna由负极向正极电泳；结束后，取出样板，在紫外透射检测仪上观察结果。 2.4.3 rna的od值测定将产物用depc处理水稀释50倍，在核算蛋白测定仪上检测rna的od值，结果见表1。 3 试验结果与分析3.1 结果表1：rna核酸蛋白测定值od260/280od260/230c（g/ml）sds法0.721.16617.8ctab法1.642.25682.9sds改进法1.501.58307.6 图1：三种不同方法提取总rna的电泳图，其中条带为ctab法提取结果，条带为sds法提取结果，条带为sds改进法提取结果。3.2 分析： rna提取以od260/230大于2.0，od260/280为1.8-2.0为佳，od260/2302.0,为异硫氰酸胍或-巯基乙醇残留；od260/2801.8，为蛋白质及酚污染；od260/2802.0，说明rna有降解，完整性被破坏。 通过分析以上实验结果，sds改进法提取效果为最好，进行电泳检测，rna 18s与28s较为清晰，但od260/2801.8,说明蛋白质或酚等出去不够完全；ctab法提取的rna进行核酸蛋白测定，od260/230偏大，sds法提取结果中，od260/230偏小。综上所述，三种方法的提取结果均未达到要求的标准，不能满足灰毡毛忍冬的后续实验。4 讨论大量研究表明，从不同植物品种、组织器官中提取高质量rna难度迥异，这主要与植物细胞中含的一些成分有关，如酚类化合物、多糖、次级代谢产物以及降解rna的rnase等12-15。在完整的细胞内，这些物质与核酸是分离的，一旦细胞碎裂，即与rna相互作用，影响高质量rna的提取16-18。所以在rna提取的整个过程中，除了保证环境的干净，操作过程中不要引入杂质及细菌外，最重要的是要除净细胞里的多糖、蛋白质及dna等杂质，以及不要残留提取过程中所加入的试剂。对于多糖，因为其许多理化性质与rna相似，因此沉淀rna时往往产生多糖的凝胶状沉淀，这种沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液而难以取样，且多糖的存在还会抑制许多酶的活性19 -20，目前，除出多糖的方法主要有高盐法21、低浓度乙醇沉淀法22和醋酸钾沉淀法23，而本次实验采用1/4体积3mol/l的kac与1/4体积的无水乙醇，取得的效果还是比较好的。对于蛋白质，细胞内大部分rna均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备rna时，首先遇到的是必须使rna与蛋白解离，并除去蛋白质。由于rna的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和苯酚法。在此次试验中，sds法的提取效果较为理想，但是仍不能消除蛋白质的污染，所以对于上述方法有必要进行进一步实验。而核酸的分离，可用水饱和酚。在酸性环境中，dna溶于酚相，rna溶于水相，可用于分离dna与rna。5 参考文献1 药典编者委员会，2010版中华人民共和国药典m.中国医药科技出版社，28-29.2 汪治，黄云.湘蕾金银花的栽培试验j.湖南中医药导报，2004,10（11）：46-47. 3 zhang x, li l,yang x. nutrient change in lonicera macranthoides during cutting propagation processj. zhongguo zhong yao za zhi,2010,35(11):1378-1381. 4 税丕先，张世波.灰毡毛忍冬规范化种植研究j.时珍国医国药，2008,19（3）：626-627.5 李萍，蔡朝晖. 5srrna基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探j.中草药，2001，32（9）：834-837.6 汪治，梅树模，郑丽，等. 灰毡毛忍冬的染色体及核型分析j.时珍国医国药，2008，19（8）：18701871.7 李俊彬，王晓明. 灰毡毛忍冬dna不同提取方法的比较实验j.湖南林业科技，2008，35（2）：1516. 8 周日宝，王珊，潘清平，等.灰毡毛忍冬issr扩增的反应体系和扩增程序研究j.中国药房，2009，20（33）：2626-2628. 9 王珊，周日宝，潘清平，等.灰毡毛忍冬种质资源遗传多样性的issr分析j.药物生物技术,2009,16(2):149-152. 10 陈大霞，李隆云. 灰毡毛忍冬自然群体遗传多样性的srap研究j.中草药，2011,42（1）：143-147.11 王暑辉，徐倩. 富含多糖多酚的侧柏叶片总rna提取方法j.北京林业大学生命科学与技术学院，2012,34（1）：76-80,8912 waish .t.a ， morgan.a.e，hey.t.d jbiochem， 1991，266 ：2342223427.13 金宇，王晓杰，韩青梅，等. 条锈菌诱导下的小麦叶片总rna提取方法的比较及ld-pcr扩增j. 麦类作物学报，2007,27（3）：471-474.14 金丽娜，姜述君，戴凌燕，等水稻抑制差减杂交技术中叶片总rna提取方法的探讨j 黑龙江八一农垦大学学报，2009，21(1)：4-7.15 谢传胜，宋国琦，王兴军，等拟南芥和烟草幼嫩种子rna 不同提取方法的比较j.2009，25(23)：78-81.16 苏丹，耿广东，张素勤，等辣椒不同组织总rna 提取方法的比较j. 江苏农业科学，2010(2)：21-22 .17 姚世响，谷丽丽，张霞，等灰绿藜rna 提