SEREX技术肿瘤相关抗原的筛选方法ppt课件

1 SEREX技术 -肿瘤相关抗原的筛选 方法 2 目录 n SEREX的概况 n SEREX的原理 n SEREX的基本流程 n SEREX发现的抗原 n SEREX的优点与缺点 n SEREX的改进 n 展望 3 SEREX概况 u 中文名称：重组表达 cDNA克隆的血清学分析技术 u 英文名称： serological analysis of recombinantly expressed cDNA clone(SEREX) u 定义：用肿瘤患者血清从肿瘤细胞 cDNA表达文库 中筛选和寻找肿瘤抗原基因的方法。 u SEREX，是 1995年由德国血清学家 Sahin等建立的 从分子水平鉴定肿瘤抗原的方法，开创了血清学 检测肿瘤抗原的新时代。 4 SEREX技术原理 n 提取肿瘤细胞或组织的 mRNA，构建 cDNA表达文 库，用含高滴度抗体的患者血清筛选 cDNA文库， 经过 2-3轮复筛后获得阳性单克隆。对所获得的阳 性克隆经过体内删除成为噬菌粒后进行序列测定 ，然后对其进行生物信息学分析，再进一步展开 对这些基因的结构和功能的研究。 5 SEREX技术基本路线 6 SEREX技术具体方法 u cDNA表达文库的构建 从新鲜肿瘤标本或肿瘤细胞株抽提总 RNA，逆转录合成 cDNA后重组到噬菌体 ZAP表达载体中，经体外包装后转 染大肠杆菌，收集噬菌体即为 cDNA表达文库。 u cDNA文库的免疫筛选 从构建的 cDNA文库抽取少量噬菌体，转染大肠杆菌，铺入 LB培养皿，孵育过夜，次日将噬菌斑转印至硝酸纤维素膜 （ NC膜），接着 5%脱脂奶粉（ NFDM）于室温封闭 NC膜 1h，后用 TBS液冲洗干净，用 1： 200经预处理的自体血清 与 NC膜室温孵育 5-6h，再用 TBS冲洗，将膜同 1： 3000稀 释的碱性磷酸酶（ AKP）标记羊抗人 IgG抗体孵育 1h，最 后进行显色反应。挑取阳性克隆，阳性克隆再次扩增进行 第 2轮、第 3轮筛选纯化。 7 SEREX技术具体方法 u 对阳性克隆进行 DNA序列分析 在 Genbank中用 BLAST进行 对比分析，判定该基因序列是已知还是未知，还可根据人 类基因组图谱对阳性 cDNA序列进行染色体基因定位。 u 采用 Southern blot或 RT-PCR检测阳性克隆 cDNA在正常组 织组织及肿瘤中的表达情况。 u 采用 Northern blot检测肿瘤抗原 mRNA的表达，确定肿瘤 抗原的组织表达谱。 u 采用 Western blot分析各种组织中肿瘤抗原的表达。 u 用已知抗原检测体内相应抗体的浓度，定量分析肿瘤特异 性抗体及其临床意义。 8 SEREX鉴定肿瘤抗原的分类 p 通过 SEREX方法已经在黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、小细胞 肺癌、等恶性肿瘤中找到了约 1500种抗原，用该方法鉴定 出来的抗原按来源和性质可分为以下几类： l CT抗原 l 分化抗原 l 突变抗原 l 过表达抗原 l 剪切变异体抗原 9 应用 SEREX发现的抗原 1. 肝癌：罗国荣等筛选出肝癌相关抗原 SMP-30和 Kinectin ，并应用基因工程技术方法构建、表达、和纯化出肝癌 相关抗原 SMP-30和 Kinectin的融合蛋白，采用 western blot和 ELISA检测出 SMP-30和 Kinectin相应抗体在肝癌患 者血清中有较高的阳性率。 2. 卵巢癌：王颖等发现 MY-OVA-13基因；周芙玲发现 12个 新基因 3. 鼻咽癌：谢可发现一个新的热休克蛋白基因家族的抗原 ；黄绍明发现了 14个新的鼻咽癌相关抗原；舒峻筛选出 16个抗原，并首次在鼻咽癌组织中筛选出金属硫 2A基因 10 应用 SEREX发现的抗原 5. 结肠癌： Scanlan等在结肠癌中发现 17个新基因 6. 大肠癌：何敬东等筛选获得 16个阳性克隆 , 代表 12个 不同抗原基因 7. 肺癌： Gure等发现 8个抗原，以 NY-LU-12抗原最重 要 8. 胰腺癌： Nakatsura等发现 5个新基因高表达 9. 白血病： Itoh等在成人 T淋巴白血病中发现 3个抗原 10. 胃癌：王运伟等筛选出 14个胃癌肿瘤相关抗原编码 基因 11 SEREX技术的优点 u 通过构建文库进行筛选 简化筛选步骤 u 筛选的抗原分子多为全长 cDNA，可诱导细胞免疫和体液 免疫，且不易导致肿瘤抗原编译丢失 u cDNA文库可以来源于肿瘤组织，也可以来源于细胞系， 筛选血清可以是自体血清，也可以是同源异体血清 u cDNA表达克隆的血清学分析，不只限于分析肿瘤细胞的 表面抗原，它涵盖了由肿瘤基因编码的大多数蛋白 u 将病人血清稀释后进行筛选，使得免疫分析仅限于那些可 以诱导强免疫反应的抗原 u 使用病人多克隆抗体血清筛选，使得在一次筛选过程中， 可以鉴定出多个抗原 12 SEREX技术的缺点 p SEREX技术必须构建 cDNA基因表达文库，并且仅局限于 对一个或者很少几个病人血清的筛选，代表性差 p SEREX技术不能检测肿瘤表达的所有抗原。 因为在 SEREX 方法中，抗原在细菌 -噬菌体系统中表达后，不能正确折 叠和翻译后修饰，所以不适用于鉴定具有翻译后修饰功能 的肿瘤相关抗原 p 对某些在肿瘤发展的不同阶段表达的抗原，若取新鲜组织 标本的时间与该抗原表达的阶段不一致也将被漏检 13 SEREX的改进 u 去除假阳性：筛选血清可以通过与野生型的细菌 -噬菌体 裂解物预吸收来消除同细菌或噬菌体复合物起反应的人血 清抗体。 u 将制成的肿瘤 cDNA文库与正常组织 cDNA文库进行消减杂 交，消减后的肿瘤 cDNA再进行血清学筛选，可排除在正 常组织中有明显表达的基因。 u 发展真核表达系统：蛋白质的构造和翻译后修饰对抗原作 用的发挥及其重要，也影响其免疫原性。 u 将蛋白质组学与 SEREX方法结合起来 14 SEREX展望 uSEREX&MDV=？ l 重组 cDNA表达文库血清学分析技术在腰椎间盘突出症自 身抗原筛选中的应用前景； 2010 l 应用 SEREX技术筛选和鉴定肺癌相关抗原的研究进展 广西医科大学研究生院； 2009 l 应用 SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原 北京市结核病胸部肿瘤研究所； 2009 l SEREX方法在肿瘤相关抗原筛选中的应用 河南中医学院基础医学院； 2009 15 l 卵巢上皮性癌相关抗原筛选中 SEREX 技术的应用 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科