脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程DB41-T 987-2014

ICS65.020

B16

DB41

河南省地方标准

DB41/T987—2014

脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程

Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor

seedling

2014-12-30发布2015-03-01实施

河南省质量技术监督局发布

DB41/T987－2014

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2术语和定义........................................................................1

2.1脱毒组培苗....................................................................1

2.2扩繁苗........................................................................1

2.3脱毒种薯（苗）................................................................1

2.4原原种........................................................................1

2.5原种..........................................................................1

2.6大田用种......................................................................1

2.7允许带毒率....................................................................2

2.8允许病毒显症率................................................................2

3检测对象..........................................................................2

4抽样..............................................................................2

4.1组培苗抽样....................................................................2

4.2田间抽样......................................................................2

5检测方法..........................................................................2

5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法...............................2

5.2指示植物检测法................................................................3

5.3聚合酶链式反应（PCR）检测法...................................................3

5.4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法..........................................3

6脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求................................................3

6.1脱毒组培苗....................................................................3

6.2原原种........................................................................3

6.3原种..........................................................................3

6.4大田用种......................................................................3

附录A（规范性附录）硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法.................4

附录B（规范性附录）指示植物检测法..................................................6

附录C（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）检测法.....................................7

附录D（规范性附录）反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法............................9

I

DB41/T987－2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河南省农业科学院提出。

本标准起草单位：河南省农业科学院植物保护研究所。

本标准主要起草人：张振臣、乔奇、秦艳红、张德胜、王爽、田雨婷、王永江。

II

DB41/T987－2014

脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程

1范围

本标准规定了脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测的术语定义、检测对象、抽样、检测方法和脱毒种薯（苗）

的检测程序及质量要求。

本标准适用于脱毒甘薯种薯（苗）的病毒检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

脱毒组培苗virus-freetissuecultureseedling

利用茎尖分生组织培养技术获得的再生组培苗，经检测，确认不含甘薯羽状斑驳病毒（Sweetpotato

featherymottlevirus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweetpotatolatentvirus，SPLV）、甘薯G病毒

（SweetpotatovirusG，SPVG）、甘薯病毒2（Sweetpotatovirus2，SPV2）、甘薯褪绿斑病毒（Sweet

potatochloroticfleckvirus，SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒（Sweetpotatochloroticstuntvirus，

SPCSV）和甘薯卷叶病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV）的种苗。

2.2

扩繁苗propagationseedling

由脱毒组培苗在无菌条件下或者防虫温（网）室内快繁后得到的甘薯苗。

2.3

脱毒种薯（苗）virus-freeseedtuberorseedling

由脱毒组培苗经逐代繁殖增加种薯（苗）数量的种薯（苗）生产体系生产出来的种薯（苗）。分原

原种、原种、大田用种三个级别。

2.4

原原种pre-elite

用脱毒组培苗或扩繁苗在防虫网室内生产出的符合质量要求的种薯（苗）。

2.5

原种elite

用原原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。

2.6

大田用种certifiedseed

用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯（苗）。

2.7

允许带毒率permissionvirus-carryingrate

各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许携带病毒植株的比率。

2.8

允许病毒显症率permissionvirus-symptomrate

1

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各级甘薯种薯（苗）繁殖田中允许出现病毒病症状植株的比率。

3检测对象

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）；

甘薯潜隐病毒（SPLV）；

甘薯G病毒（SPVG）；

甘薯病毒2（SPV2）；

甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）；

甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）；

甘薯卷叶病毒（SPLCV）。

4抽样

4.1组培苗抽样

4.1.1脱毒组培苗

每株均应检测。

4.1.2扩繁苗

随机抽取1%～2%的扩繁苗检测。

4.2田间抽样

4.2.1原原种田抽样

定植后30d、60d、收获前2周，在目测的基础上，采用五点取样法。面积≤0.1hm2，抽取数量为

200株；0.1hm2＜面积≤1hm2，抽取数量为500株；每超出1hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定

的面积取样。每株取上、中、下部叶片1g～5g，-20℃以下低温保存。

4.2.2原种田和大田用种田抽样

定植后30d、收获前两周，在目测的基础上，采用五点取样法。取样方法及样品保存同4.2.1。

5检测方法

5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法

用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录A。

5.2指示植物检测法

用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒，检测法见附录B。

5.3聚合酶链式反应（PCR）检测法

用于检测SPLCV。检测法见附录C。

2

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5.4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

用于检测SPCSV。检测法见附录D。

6脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求

6.1脱毒组培苗

样品同时利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4种方法进行检测，4种方法的检测结果均应为阴

性，即允许带毒率为0。

6.2原原种

先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物法进行检测，至少其中10%的样品分

别利用PCR和RT-PCR检测。允许带毒率为0，允许病毒显症率为0。

6.3原种

先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中5%的样品分别

利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的允许

带毒率为0。允许病毒显症率≤1.0%。

6.4大田用种

先目测调查样品的病毒显症率，然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测，至少其中1%的样品分别

利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤10.0%，SPCSV和SPLCV的允许

带毒率为0，允许病毒显症率≤5.0%。

3

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AA

附录A

（规范性附录）

硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法

A.1溶液配制

除非另有规定仅使用分析试剂。水为无菌蒸馏水。

A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：称取60.60g的三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于

300mL无菌蒸馏水中，加入32.5mL浓盐酸（HCl），调节pH值为7.5，定容至500mL。4℃保存备用。

A.1.2氯化钠溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：称取292.20g氯化钠，在800mL无菌蒸馏水中，溶解定容至

1L。4℃保存备用。

A.1.3三羟甲基氨基甲烷溶液（TBS）：分别取1mol/LTris-HCl（A.1.1）20mL和5mol/L氯化钠

（A.1.2）100mL，混合后用无菌蒸馏水定容至1L。

A.1.4洗涤缓冲液（TBST）：0.5mL吐温-20（Tween-20）溶于1LTBS（A.1.3）中。

A.1.5抽提缓冲液：称取亚硫酸钠（Na2SO3）0.20g溶于TBS（A.1.3）中，定容至100mL。

A.1.6封闭缓冲液：称取脱脂奶粉0.50g，分别量取曲拉通（Triton）X-1000.5mL和TBS（A.1.3）

25mL。先将脱脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25mL，加入TritonX-100

混合均匀，现配现用。

A.1.7抗体缓冲液：称取脱脂奶粉1.00g，量取TBS（A.1.3）50mL。先将脱脂奶粉溶解于少量TBS

（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至50mL。

A.1.8底物缓冲液：分别称取三羟甲基氨基甲烷6.10g、氯化钠2.90g、氯化镁（MgCl2•6H2O）

0.50g，溶于400mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500mL。

A.1.9氯化硝基四氮唑蓝（NBT）储备液：称取0.04gNBT溶于1.2mL70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）

中，-20℃避光保存备用。

A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储备液：称取0.02gBCIP溶于1.2mLN，N-二甲基甲酰

胺（DMF）中，-20℃避光保存备用。

A.1.11NBT/BCIP底物溶液：先后取100µLNBT贮备液（A.1.9）和100µLBCIP贮备液（A.1.10），加

入25mL底物缓冲液中，振摇混匀,现配现用。

A.2样品制备

将待测叶片用清水清洗干净，从每一样品上中下部的叶片上各取一直径约1cm圆片。放入研钵中，

加入3mL抽提缓冲液充分研磨，6000r/min离心2min，取上清液点膜。

A.3操作步骤

A.3.1点膜

将划好方格（1cm×1cm）的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸

取15µL上清液滴在膜上方格的正中，室温干燥15min～30min。同时设阳性、阴性和空白对照。根据

需要设置重复。

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A.3.2封闭

将干燥后的膜浸入封闭缓冲液中，室温下摇床振荡1h，转速为50r/min。

A.3.3与一抗反应

将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的病毒特异性抗体溶液中，室温下摇床振荡10h～12h，转

速为50r/min。

A.3.4洗膜

用洗涤缓冲液洗膜4次，每次摇床振荡3min，转速为80r/min。

A.3.5与二抗反应

用滤纸将膜表面的溶液吸干，将膜放入用抗体缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酶标记的抗体溶液

中，室温下摇床振荡1h，转速为50r/min。

A.3.6洗膜

洗涤4次，方法同A.3.4。

A.3.7显色

用滤纸将膜表面的溶液吸干，将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，避光缓慢摇动。

A.3.8终止反应

弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡10min，转速为50r/min。

A.3.9结果判断

晾干后观察颜色反应，阳性样品在膜上形成紫色沉淀，阴性样品则无颜色反应。

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BB

附录B

（规范性附录）

指示植物检测法

B.1繁育指示植物

在防虫条件下盆栽巴西牵牛（Ipomoeasetosa），至1～2片真叶时嫁接。

B.2嫁接

以待测样品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部（子叶处）斜切，将待检样品底端

削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置25℃～30℃防虫网室内，嫁接15d～30d后观察记

载症状。每个样品重复至少3次（3株），同时设阳性和阴性对照。

B.3结果判断

根据巴西牵牛是否表现花叶、叶片扭曲、明脉、黄化以及植株矮化等症状，确定是否带毒。所有嫁

接的巴西牵牛植株均没有表现任何病毒病症状，样品为阴性；只要有1株表现病毒病症状，该样品判断

为阳性。

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CC

附录C

（规范性附录）

聚合酶链式反应（PCR）检测法

该方法用于检测甘薯卷叶病毒（SPLCV）。

C.1试剂及缓冲液配制

先用按C.1.1～C.1.6配方配置50倍的浓贮存液，使用时再用无菌蒸馏水稀释至工作浓度。

C.1.1TAE电泳缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2EDTA•2H2O

37.2g，用氢氧化钠调pH值至8.5，灭菌双蒸水定容至1L。

C.1.2溴化乙锭（EB）溶液：称取溴化乙锭20.00mg溶于20mL灭菌双蒸水中。

C.1.31.0%琼脂糖凝胶板：称取1.00g琼脂糖加入100mLTAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热至琼脂

糖融化，温度降至50℃～60℃时，加溴化乙锭溶液（EB）5µL，摇匀，倒入电泳槽中均匀铺板，凝固

后取下梳子使用。

C.1.4CTAB缓冲液：称取CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）20.00g、NaCl81.80g、EDTA5.80g和

Tris12.10g，溶于1L蒸馏水中，用HCl调pH值至8.0，高温灭菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）

10.00g。

C.1.5TE缓冲液：称取EDTA0.30g和Tris1.20g，溶于1L蒸馏水中，用HCl调pH值至8.0，高温灭菌。

C.1.6加样缓冲液：称取EDTA0.88g、溴酚蓝0.05g，量取丙三醇36mL，溶于100mL蒸馏水中，

用氢氧化钠调pH值至7.0。

C.2DNA提取-CTAB法

预热（60℃）CTAB缓冲液(C.1.4)。取0.5g新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有

预热的600µLCTAB缓冲液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中，再加入20µL巯基乙醇，轻轻混匀；

60℃保温1h，其间摇动几次；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻混匀，室温下4500r/min

离心10min；将上清液转入另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，小心混匀后-20℃放置30min以上，

可见DNA絮状沉淀；10000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀加清洗缓冲液（70%乙醇，100mmol/L

醋酸铵）漂洗2～3次，10000r/min离心10min，沉淀风干后溶于50µLTE缓冲液(C.1.5)。开展后续

试验或-20℃保存备用。

C.3PCR

C.3.1引物

上游引物BM-V：5ˊ-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC-3ˊ，

下游引物BM-C：5ˊ-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3ˊ。

C.3.2PCR扩增

PCR反应体系为：灭菌重蒸水36.7µL，dNTPs（2.5mmol/L）4µL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

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DB41/T987－2014

5µL，上游引物BM-V（10µmol/L）和下游引物BM-C（10µmol/L）各1µL，ExTaqDNA聚合酶(5U/µL)

0.3µL，模板DNA2µL。PCR反应条件为：94℃3min，接着进行35个循环，条件为94℃1min、

55℃1min和72℃3min，最后72℃延伸10min。

C.3.3PCR产物的电泳检测

制备1.0%琼脂糖凝胶板（C.1.3）。在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液(C.1.1)。每个样品取10µLPCR

产物与加样缓冲液混合后，加入凝胶孔进行电泳。恒压（120V～150V）下电泳20min～30min，经EB

染色后，将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。

C.3.4试验成立的条件

PCR产物经电泳检测，阳性对照在预期大小（2800bp）的位置出现特异性条带，同时，阴性对照和

空白对照均没有出现预期大小的目的条带。

C.3.5结果判定

应用本标准的检测方法对待检样品进行检测，如果在2800bp对应位置出现特异性条带，则判定样

品为SPLCV病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。

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DD

附录D

（规范性附录）

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

该方法用于检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）。

D.1试剂及缓冲液配制

D.1.1DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC)50µL加至100mL灭菌蒸溜水中，室温放置10h～12h，

121℃高温灭菌15min，分装到DEPC（D.1.1）处理过的离心管中。

D.1.2引物溶液：用DEPC水（D.1.1）将上、下游引物分别配制成浓度为10µmol/L的溶液。

D.1.3TAE电泳缓冲液、1.0%琼脂糖凝胶板和溴化乙锭（EB）溶液：TAE电泳缓冲液、溴化乙锭（EB）

溶液和1.0%琼脂糖凝胶板配制方法分别同附录C.1.1、C.1.2和C.1.3。

D.2RNA提取-Trizol法

称取0.1g叶片放于研钵中，加液氮充分研磨成粉，将粉末迅速转入到无RNase的无菌1.5mL离心

管中，加入1mLTrizol迅速振荡混匀；4℃12000r/min，离心5min；取上清液，加入200µL氯仿，

混匀，室温放置15min；4℃，12000r/min，离心15min；吸取上层水相至新的无菌1.5mL离心管中，

加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃，12000r/min，离心10min，弃上清液，留沉淀；

加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃，12000r/min，离心5min，弃上清液，将离心

管倒置于灭菌滤纸上，自然干燥；加入25-200µLDEPC水（D.1.1）溶解沉淀，即得到总RNA。

D.3RT-PCR

D.3.1引物

上游引物CSV70P1：5ˊ-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3ˊ，

下游引物CSV70P2：5ˊ-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3ˊ。

D.3.2反转录

反转录反应体系为：dNTPs（10mmol/L）1µL，MgCl2（25mmol/L）1µL，5×AMV缓冲液2µL，

AMV（5U/µL）0.5µL，RNase抑制剂（40U/µL）0.25µL，模板核酸5µL，下游引物CSV70P2（10µmol/L）

0.5µL。反转录反应条件为：42℃50min，99℃5min。

D.3.3PCR扩增

PCR反应体系为：灭菌重蒸水33.7µL，dNTPs（2.5mmol/L）4µL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

5µL，上游引物CSV70P1（10µmol/L）和下游引物CSV70P2（10µmol/L）各1µL，ExTaqDNA聚合酶

(5U/μL)0.3µL，cDNA5µL。PCR反应条件为：94℃3min，接着进行35个循环，条件为94℃30s、

55℃30s和72℃50s，最后72℃延伸10min。

D.3.4PCR产物的电泳检测

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DB41/T987－2014

制备1.0%琼脂糖凝胶板（C.1.2）。在电泳槽中加入1×TAE缓冲液。每个样品取10µLPCR产物与

加样缓冲液混合后，加入凝胶孔进行电泳。恒压（120V～150V）下电泳20min～30min，经EB染色后，

将凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。

D.3.5试验成立的条件

PCR产物经电泳检测，阳性对照在预期大小（431bp）的位置出现特异性条带，同时，阴性对照和

空白对照均没有出现预期大小的目的条带。

D.3.6结果判定

应用本标准的检测方法对待检样品进行检测，如果在431bp对应位置出现特异性条带，则判定样品

为SPCSV病毒阳性，否则判定样品为该病毒阴性。

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目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2术语和定义........................................................................1

2.1脱毒组培苗....................................................................1

2.2扩繁苗........................................................................1

2.3脱毒种薯（苗）................................................................1

2.4原原种........................................................................1

2.5原种..........................................................................1

2.6大田用种......................................................................1

2.7允许带毒率....................................................................2

2.8允许病毒显症率................................................................2

3检测对象..........................................................................2

4抽样..............................................................................2

4.1组培苗抽样....................................................................2

4.2田间抽样......................................................................2

5检测方法..........................................................................2

5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法...............................2

5.2指示植物检测法................................................................3

5.3聚合酶链式反应（PCR）检测法...................................................3

5.4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法..........................................3

6脱毒种薯（苗）的检测程序及质量要求................................................3

6.1脱毒组培苗....................................................................3

6.2原原种........................................................................3

6.3原种..........................................................................3

6.4大田用种......................................................................3

附录A（规范性附录）硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定（NCM-ELISA）检测法.................4

附录B（规范性附录）指示植物检测法..................................................6

附录C（规范性附录）