抗血清制备及抗体效价检测

短期免疫抗血清制备及抗体效价检测 黄健，应技 1201,2012304200315 摘要 通过一定程序注射颗粒性抗原或可溶性抗原免疫小鼠和家兔，是实验室制 备多克隆抗血清的常用方法。虽然依据常规免疫方案可以制备出效价高、亲和 力强的抗血清，但整个常规方案耗时近个多月，也容易受到免疫动物健康状 况的影响和饲养成本的限制。本试验以牛血清白蛋白为抗原缩短免疫注射周期， 对小鼠和家兔进行短程快速免疫。并进行效价检测，以探讨短程快速免疫方案 的实效性。 关键词 免疫，抗血清，抗原，ELISA 主线实验分为三个小实验分别为：实验一：免疫小鼠（每组一只） ，家兔 （每班一只） 。实验二：对免疫后的小鼠和家兔进行抽血、放血，其中老鼠采用 断尾取血家兔采用颈动脉放血，分离抗血清 。实验三：ELISA 测定抗体效价。 另有一个穿插实验：血型鉴定。 1 实验一：免疫 用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形 成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体 量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗 血清。 为了制备高效价的抗血清，我们需要考虑下列五个因素。实验动物的免疫反应 性 ，抗原的免疫原性，抗原的剂量，免疫途径，免疫时间间隔。 1.1 实验动物的选择 常用的免疫动物有家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。免疫用动物应选 适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择选择年龄在 6 个月以上当年繁殖的 性，体重 23 公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料 涂沫在动物的背部，作出明确的标记。同时应考虑抗原与动物的种属关系、抗 原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。 我们此次选用小白鼠（每组一只） ，家兔（每班一只） 。 1.2 实验步骤 1).编号标记 35苦味酸溶液或 8090苦味酸酒精饱和液分别标记左前腿上部 为 1，左腰部为 2，左后腿为 3，头部为 4，背部为 5，尾基部为 6，右侧从前至 后依次为 7、8、9。 2).免疫 合成免疫原为 2mg(半抗原约为 20200 g)。家兔为 300600 g/次（400） ，每次 不超过 2mL；小鼠为 10100 g /次（10-20，2040 g / ml） ，每次不超过 0.5mL。首 免需要与等体积的福氏完全佐剂混合，二免与等体积的不完全福氏佐剂混合，三免、四免 不用佐剂。 家兔可采用皮下（脚掌） ，皮内，耳静脉，肌肉，淋巴结等不同部位进行免疫。 小鼠则采用腹腔注射，方法为以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射 针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.51.0cm，再以 45 度角穿 过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。（为避免伤及内脏，可使动物处于头低位， 使内脏移向上腹。 ） 2 实验二：抽血、放血，分离抗血清 2.1 取血 1).老鼠采用断尾取血 将小鼠放入一个盖子上打孔的恰好能放进老鼠的离心管中，尾吧从盖子孔 中穿出用以固定小鼠。先用酒精棉球对小鼠尾部末端消毒，然后用消毒后的手 术剪剪断小鼠尾部末端。用 1ml 离心管接血，为了让血液尽可能快的流出，可 用手从上而下按摩小鼠尾部。 2).家兔采用颈动脉放血 家兔固定（仰卧，身体及头部固定）-剪毛（颈部）-找颈动脉管（消毒 -剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动） -小心分开动脉上的肌肉、神经（2 条，白色）等-开口（见图）-放血， 接入 100ml 无菌空三角瓶。（注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、 钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！） 2.2 抗血清的分离，保存 斜置装血液的三角瓶 0.5-1h；用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于 血清析出） ； 原样包扎好三角瓶，与装有小鼠血液的离心管一同做好记号，放进冰箱 （4）过夜； 次日（时间待定）：估计各班分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块， 离心取上清（3000rpm,20min） ，加叠氮钠（终浓度为 0.1%，注意防护！） ， 混匀，分装小管，作好标记，-20 或-80保存待测。 3 实验三：ELISA 法测定抗体效价 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称 ELISA) 是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ELISA 过程包 括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗 原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底 物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。 3.1 实验材料 牛血清白蛋白（BSA) 抗原，10 g/ml 溶液，包被液配制 鼠抗 BSA 待测抗体样品，用 PBST 从 1：1000 开始倍比稀释，连续稀释 8 个稀释度 HRP 标记羊抗小鼠 IgG 二抗（按说明书稀释使用，用 PBST 稀释。每 班 8 个板，480 孔，总量 48000 l，实际 5.5 l 到 55ml） 包被缓冲液：0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59 克，NaHCO3 2.93 克，加水 900ml，调 pH，再定容至 1L） 0.01M PBS 溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g 或 Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至 1000ml，pH7.4） PBST 洗涤液：含 0.05 % Tween 20 的 0. 0001 M 的 PBS（ pH 7.4 ） 底物溶液：TMB（ 3,3,5,5-四甲基联苯胺） 2M H2SO4 （市售浓硫酸为 18.4 M，根据要配制的 2M 硫酸体积，吸管吸好 相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中） 酶标板，酶标仪，保鲜膜，排枪 3.2 实验步骤 1).加抗原： 取酶标板，加入 100l/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加） 2).包被抗原： 保鲜膜包好， 37 1h 或 4 过夜 抗原分子通过疏水作用力结合到 96 微孔板上 3).封闭： 甩干后以 PBST（200l/孔）洗涤 3 次，3min/次 每孔加入 100 l 5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用 PBS 溶液配制） 保鲜膜包好， 37， 2h 4).加待测血清 取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体 以 PBST（200l/孔）洗涤 3 次，3min/次 标记各孔，加入相应稀释度的抗体 100l/孔 （用 PBST 稀释，按示意图用单枪加） 37，保鲜膜包好，60min 5).加二抗： 甩干孔内液体 以 PBST（200l/孔）洗涤 4 次，3min/次 各孔加入酶标二抗 100l/孔（用 PBST 稀释 10000X,全班每 8 板需 48ml，实配 55ml） 37，保鲜膜包好，45min 6).显色： 甩干孔内液体 以 PBST（200l/孔）洗涤 4 次，3min/次 加入 TMB 底物溶液 50L/孔 避光显色 10min(抽屉中） ，然后每孔加入 50 l 的 2M 硫酸终止反应 3.3 结果分析 B2 到 D3 的值都在 0.1 以下，与后面的值差别不大，说明免疫效果很不好。原 因可能是多方面的。但是不可否认的是短期免疫可靠性不大，即使是做出了抗 血清，也基本只能达到 的稀释度。22到 23 4 玻片法血型鉴定（兴趣实验） 4.1 实验方法和步骤 1).受检抗原（血样）制备： 用酒精棉球消毒手指-待干后用无菌 5#针刺消毒部位-取一滴血（大绿豆 大小