基因组学专题课程作业

基因组学专题课程作业 考试题目： 假如你发现一个新基因，请利用基因组学的思路，方法，技术路线设计可 行的 假如你发现 个新基因，请利用基因组学的思路，方法，技术路线设计可行 的实验方案，研究它的功能，寻找出它所影响的下游基因，可能与此蛋白相互 作用的其它蛋白，以及调控它表达的上游基因。（选择一个你所熟知的模式生 物。） 答案： 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类 生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无 处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工 农业、环保等诸多领域。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在疾病的预防和治 疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生， 像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。 大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致 耐药性的产生。微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但 是微生物也有有益的一面。青霉素的发现对医药界来讲是一个划时代的发现。 后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。一些微生物被广泛应用 于工业发酵，生产食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废 水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极 端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生 命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。 随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟 悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以 及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此 阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在 分子水平上研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学 来说是一场革命。 与真核生物相比，虽然微生物的基因组相对简单，但微生物基因组学研究 仍具有重大的科学和经济意义。在细菌基因组中，既有编码在极端环境下起催 化作用的酶的基因，也有编码分解化学污染物的酶的基因，这些基因在真核细 胞是不存在的。通过微生物功能基因组学研究，还能发现药物靶位和疫苗抗原。 微生物基因的功能及表达研究结果也能为研究复杂生物的基因功能提供参考。 近些年微生物功能基因组学研究受到了普遍重视。日本组织了十几所大学 和研究机构，计划用年时间完成大肠杆菌的功能基因组研究。日本还与欧洲联 合正在开展枯草杆菌功能基因组学研究。其它微生物的功能基因组学研究也在 进行中。 在这里我以 E. coli 为例，在 E. coli 中发现了一个新基因 X，我们可以通过 以下几种方法来对其进行研究。 1 Genetic mutation and complementation。 在 E. coli 中把该基因敲除掉以后，对获得的的突变菌株进行一系列表型检 测，获得表型数据以后，对该突变菌株进行该基因的回补，看敲除菌株中发生 变化的表型在回补菌株中是否有回复，如果有回复，则说明该基因与该表型的 变化直接相关。在用质粒回补的时候，应该使用该基因本身的启动子或者 E. coli 看家基因的启动子进行回补，以确保基因表达水平接近于基因在基因组中 的表达水平。 2 RNAi RNA 干扰（RNA interference，缩写为 RNAi）是指一种分子生物学上由双 链 RNA 诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑 制基因表达。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默。RNAi 现象在生物中普遍存在。RNAi 与 转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子 层次上被证实是同一种现象 RNAi 在基因沉默( silent gene)方面具有高效性和简单性，所以是基因功能 研究的重要工具。RNAi 是一种高效的特异性强的基因阻断技术 ,近年来发展迅 速,很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将 dsRNA 分子导入 细胞内, 特异性地降解细胞内与其序列同源的 mRNA ,封闭内源性基因表达,从反 向遗传的角度研究微生物基因组中未知基因的功能。 我们可以用 RNAi 的方法关闭吧 X 基因的功能，并对关闭功能后的菌株进 行一系列表型检测。 3 Promoter analysis 启动子是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始 mRNA 合成的序 列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。 原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对 mRNA 的合成极为重要，并且启动子有强弱之分，在一定程度上可以在转录水平上代 表基因的表达情况。 根据基因对表型的影响，联系代谢网络图，确定可能受到 X 基因调控的基 因，在野生型和缺失菌株中测定这些基因的 promoter 活性。若 promoter 活性有 明显变化，则该基因很有可能是受到 X 基因调控的下级基因，若在突变体中活 性增加，则这一基因的表达是受到 X 基因抑制，若在突变体中活性下降，则这 一基因的表达是受到 X 基因的促进的。 4 qRT-PCR 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）通过荧光强度变化监测扩增产 物量变化。其优点是灵敏性好，精确度高，污染小。尤其是可以在样品量很少 时达到定量检测基因表达的目的。qRT-PCR 监测检测的是细胞质内 mRNA 水 平，在一定程度上可以在转录水平上代表基因的表达情况。qRT-PCR 的结果与 Promoter analysis 可以互为辅助来分析问题。 我们可以在野生型和缺失突变体中对可能与 X 基因有关的基因进行 qRT- PCR 检测来分析这些基因的表达情况，进而确定可能与 X 基因有相互作用的基 因，或者寻找到受到 X 基因调控的下游基因。 5 Protein-DNA interaction 若我们可以确定 X 基因是一个 regulator，我们可以通过检测 X 基因编码的 蛋白质与特定的 DNA 序列之间是否存在相互作用来确定 X 基因可能调控的下 游基因。 检测 Protein-DNA interaction 的方法有很多，如细菌单杂交实验，足迹实验， 甲基化干扰实验，DNase 1 足迹实验，Pull-down assay ，Pull-down assay，Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assays，DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)，Microplate Capture and Detection Assay。这都是在 体外进行 Protein-DNA 互作实验的方法。有时候可能不能真实地反映在生物体 内的分子相互作用。 有一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay ），该方法可以看做是体外 DMS 足迹实验的一个变种。体内足迹试验的原理原则上同体外 DMS 足迹实验 无本质差别。这一实验可以较为真实地反映 Protein 与 DNA 之间的相互作用。 6 Protein- Protein interaction 有很多方法可以检测蛋白质之间的相互作用。如细菌双杂交实验，噬菌体 展示技术，等离子共振技术，荧光能量转移技术，抗体与蛋白质微阵列技术， 免疫共沉淀技术和 pull-down 技术。 通过检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以构建出以 X 基因产物为中 心的一个蛋白质相互作用的网络。若我们检测出与 X 基因产物能够相互作用的 蛋白功能是已知的，我们可以根据这个结果对 X 的功能进行推测。 7 cDNA microarray DNA 芯片，又称基因芯片是新近发展起来的能够同步高通量高灵敏度低消 耗地分析细胞内基因表达谱的技术可以对处于不同时相不同疾病时期的组织细 胞细胞系进行基因表达谱比较性分析可用于基因差异表达分析传染病诊断肿瘤 的发生机制肿瘤分型和诊断等研究在医学的基础研究和临床应用方面有着广阔 的前景。 检测时，以来自 A 基因突变株的 mRNA 为模板，用微量点样法制作 cDNA 微阵列，使用放射性元素或者荧光作为检测信号，用计算机检测在突变株中基 因的表达情况，我们可以大量的获得有关在突变株中基因表达与否与基因表达 水平的信息，结合以上的实验结果可以对 X 基因的功能有一个较为全面的认识。 参考文献： 1. 陈金华. 2010. 环境微生物的宏基因组学研究进展. 吉林农业. 2. 陈伟, 王远志, 李永祥, 米利古, 张辉, 张娟, 魏克娜, and 袁俐. 2012. qRT-PCR 检测结核分枝杆菌蛋白抗原编码基因表达水平. 中国实验诊断 学 15:2004-2007. 3. 韩天龙, 王敏, and 李志明. 2011. QRT-PCR 检测目的基因 mRNA 转录 水平的应用. 安徽农业科学 39:18432-18434. 4. 胡福泉. 2001. 微生物基因组研究进展. 细胞与分子免疫学杂志 17:402-402. 5. 黄留玉, 王恒樑, 史兆兴, 朱厚础, and 苏国富. 2003. 微生物功能基 因组学研究. 微生物学报 43:432-438. 6. 徐持华, 张国梁, 赵职卫, 夏颖, 张秋萍, and 毕勇毅. 2006. 用 cDNA 微阵列芯片检测苯中毒细胞色素 P450 基因表达差异. 公共卫生与预防医学 17:16-19. 7. 徐持华, 张国梁, 赵职卫, 夏颖, 张秋萍, and 毕勇毅. 2006. 用 cDNA 微阵列芯片检测苯中毒细胞色素 P450 基因表达差异. 公共卫生与预防医学 17:16-19. 8. 袁建平, and 郭晓奎. 2003. 基因芯片在细菌基因组学和细胞微生物学 研究中的应用. 生命科学 15:178-182. 9. 张蔚, 方芙蓉, 徐小霞, and 洛若愚. 2006. 应用 c