基因治疗技术综述

中央民族大学生命与环境科 学学院分子生物学论文 姓 名： 曾宇翔 学 号： 1044002 专 业： 10 生物技术 指导教师 ： 徐小静 基因治疗技术综述 2013 年 4 月 27 日 基因治疗技术综述 曾宇翔 （中央民族大学生命与环境科学学院 北京 100081） 摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，具有广阔的发展前景。基因治疗有望成为治疗遗传病，癌症，心血 管病及其他难治性疾病的有效手段，目前以取得一定进展。本文主要对基因治疗技术的现状、方法、问题 和未来发展等几方面进行综述。 关键词：基因治疗；策略；方法；应用。 20 世纪是科技空前发展的时代，同样也是“生物大发现”的时代，而 21 世纪是基因 治疗技术发展的时代。自 1989 年人类史上首次基因治疗方案在北京实施以来，到目前为止， 基因治疗技术已经在世界各国广泛开展。基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段， 在一定程度上取得了重大进展。然而基因治疗啊依然存在诸如缺少高效的传递系统、缺少 持续稳定的表达和寄主免疫等一系列问题。但我们相信随着科学家对基因的不断深入研究， 基因治疗一定会给人类健康事业做出巨大的贡献。本文从以下几方面将国内外近年基因治 疗技术的研究情况做一综述。 1 基因治疗概念 基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿治病基因锁产生的缺陷， 从而达到治疗疾病的目的的生物学高新技术。基因治疗有着狭义和广义的概念，狭义概念 指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的； 广义概念指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的 方法。实施基因治疗的所需步骤大致有：(1)目的基因的筛选和植被；（ 2）基因载体的选 择；（3）靶细胞的选择；（4）细胞转染：（5）基因的表达检测。 2 基因治疗的方法 目 前 基 因 治 疗 有 二 种 形 式 ： 一 是 体 内 疗 法 ， 把 一 个 将 抗 的 基 因 拷 贝 插 入 靶 细 胞 以 补 偿 缺 陷 基 因 ； 二 是 体 外 疗 法 ， 引 进 经 过 改 造 的 基 因 赋 予 细 胞 新 的 特 征 。 这 两 者 都 属 于 体 细 胞 基 因 治 疗 ， 还 有 一 种 生 殖 细 胞 基 因 治 疗 ， 通 过 干 细 胞 或 者 生 殖 细 胞 进 行 介 导 的 治 疗 手 段 ， 由 于 涉 及 一 系 列 伦 理 学 问 题 ， 目 前 仍 属 禁 区 。 体 内 疗 法 将 外 源 基 因 导 入 受 体 体 内 有 关 的 器 官 组 织 和 细 胞 内 ， 以 达 到 治 疗 疾 病 的 目 的 。 这 是 一 种 简 便 易 行 的 方 法 ， 体 细 胞 基 因 治 疗 通 过 载 体 直 接 传 送 ， 将 治 疗 性 转 基 因 制 作 出 来 ， 然 后 包 装 入 载 体 中 ， 直 接 注 射 到 病 人 体 内 ， 到 达 靶 器 官 。 但 其 缺 点 是 基 因 转 染 率 较 低 。 目 前 研 究 和 应 用 较 多 的 还 是 体 外 疗 法 ， 即 将 有 基 因 缺 陷 的 细 胞 取 出 ， 在 体 外 将 外 源 基 因 导 入 到 载 体 细 胞 ， 然 后 将 基 因 转 染 后 的 细 胞 输 给 受 着 ， 使 携 有 外 源 基 因 的 载 体 细 胞 在 体 内 表 达 治 疗 产 物 ， 以 达 到 治 疗 目 的 。 3 基因治疗的策略 3.1基因矫正功能 对于致病基因中的异常碱基进行精确恢复，而正常部分予以保留，使细胞恢复正常。 这种方式在操作中要求高，实践中有一定难度。 3.2基因置换 指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的 DNA 完全恢复正 常状态。这是最理想的基因治疗策略，尚处于基础研究阶段，未能从理论和技术上得到突 破。 3.3基因增补 不删除突变的致病基因，而在基因组内额外插入正常基因，致病基因仍在其中，正常 基因在体内表达出功能正常的蛋白，达到治疗疾病的目的，是目前主要使用的基因治疗策 略。 3.4基因失活 向患者体内导入有抑制基因表用的反义 RNA、核酸，干扰 RNA 等，通过这类物质抑 制或降解相应的 mRNA，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。 3.5自杀基因 在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化 为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因” 。 3.6免疫治疗 将某种抗体、抗原或者细胞因子的基因导入病人体内，从而改变病人的免疫状态，达 到预防和治疗疾病的目的。比如将白细胞介素-2 导入肿瘤病人体内，提高病人 IL-2 的水平， 激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。 3.7耐药治疗 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性 的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。 4 基因治疗载体 有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这很大程度上取决于 所用的载体系统。目前外源基因的转移方法主要有病毒法和非病毒法： 4.1病毒载体 病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA 病 毒能整合到染色体上等。因此病毒载体是良好的基因运转载体，现在绝大多数基因治疗临 床项目采用病毒载体。 4.1.1RAN 病毒载体 最常见的 RNA 病毒载体来源于逆转录病毒，逆转录病毒属于正练 RNA 病毒，可高效 地感染许多类型的宿主细胞，它虽然是 RNA 病毒名单是有逆转录酶，可使 RNA 转录为 DNA，在整合到宿主细胞。逆转录病毒是最先且最广泛的基因治疗载体，逆转录病毒表面 的糖蛋白能被很多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，因而可以高效地将基因转移到 感染细胞。它能感染光谱动物物种而无严格的组织特异性。被转移的外来基因能整合到感 染细胞中而不丢失。 慢病毒载体是以 HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体， 他对分裂细胞和非分裂细胞都具有感染能力，它能再不存在细胞因子的情况下转换造血前 体细胞。目前以在动物模型上取得了较好的结果。此外，慢病毒载体治疗神经疾病具有较 大的应用前景。 4.1.2 腺病毒载体 腺病毒是线性双链 DNA 病毒，在自然界中分布广泛。DNA 每条链上都有重叠的转录 单位。病毒基因组通过核孔进行转运，使初始转录的启动更容易。腺病毒载体具有容量大， 可感染分裂和不分裂细胞，感染效率高，无插入致变性，增殖多等优点。但也存在一些问 题，比如腺病毒如何绕开人体的免疫系统，宿主范围广泛使得腺病毒难以针对某一特定组 织。 4.1.3 单纯疱疹病毒载体 人单纯疱疹病毒是大分子量双链 DNA，可容纳大片段外源 DNA。I 型单纯疱疹病毒 (HSV-1)属于人嗜神经病毒，可在神经元内建立潜伏感染。HSV-1 可被改造成两类载体： 一是扩增子载体。即仅把 HSV 的复制起点和包装信号序列插入到细菌质粒中；当其转染到 细胞，用 HSV 辅助病毒超感染，便可获得含有扩增子的假病毒。另一类为重组载体，即删 除了与复制相关及非必须基因，以减少细胞毒性，然后插入外源基因，用于宿主神经细胞 长期表达外源基因。 4.2非病毒载体 迄今已完成的基因治疗临床研究结果都不尽如人意，其最大困难在于开发无毒、高效 地基因治疗载体。虽然多数研究仍采用转染效率较高的病毒载体，但其非靶向性，有限携 带能力、生产安全等问题，使得非病毒基因治疗载体倍受关注。非病毒载体包括裸 DNA， 脂质体，纳米颗粒及其他一些方式，以脂质体与阳离子聚合物使用较多。 5 基因治疗技术的应用 5.1遗传性疾病的基因治疗 1991 年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案,即将腺苷脱氨酶 （ ADA ）导入一个 4 岁患有严重复合免疫缺陷综合征（ SCID ）的女孩.。采用的 是 反转录病毒介导的间接法,即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白 细胞, 8 个月后,患儿体内 ADA 水平达到正常值的 25 ,未见明显副作用.此后又进行第 2 例治疗获得类似的效果.。我国复旦大学等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的 探索,他们在兔模型的基础上,将人第 因子基因通过重组质粒（ pcmvix ）或重组反转录 病毒（ N2CMVIX ）导入自体皮肤成纤维细胞 ,获得可喜的阶段性成果。对于其他遗传病 如杜氏营养不良症、帕金森等疾病的研究，也已取得一定进展。相信未来基因治疗会取得 巨大成功。 5.2恶性肿瘤的基因治疗 许多癌症的发生是由于癌基因的激活过度而表达的，因此可以通过影响癌基因的转录 反义等过程来达到扰乱癌基因的功能。采用基因失活策略，将反义 RNA，进入癌细胞，阻 止特定 mRNA 序列表达，使其丧失产生癌基因蛋白质的能力，通过研究表明对癌细胞具有明 显的作用。通过基因免疫治疗癌症是目前最为广泛的一种方法，通过向患者体内引进能增 强患者免疫功能的基因，增强患者自身的免疫系统以达到治愈癌症的目的。 5.3其他方面的基因治疗 1994 年，肥胖有关的瘦基因的发现，为肥胖的基因治疗展示了美好的前景，这项技术 已在老鼠身上取得成功。歇顶相关基因的发现，为很多秃顶男性带来福音。基因治疗将来 有可能治疗人们受伤的肌肉或骨折，初期的人体试验已经开始，专家们相信这种试验会发 展到治疗阶段。基因治疗还在创伤修复、减少疤痕、抗衰老以及器官移植等方面有着相当 明显的作用。 6 基因治疗技术存在的问题 过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上也遇到了很多困难。 除了道德伦理问题之外，目前尚存的主要问题是： 6.1基因治疗的副作用 自 2000 年以来，法国巴黎内克尔医院对 17 名患有严重联合免疫缺陷病的儿童实施基 因疗法，将正常的基因植入患儿体内，修复有缺陷的免疫系统。但从 2003 年开始，有 5 名 患者出现白血病症状，后有一名患病儿童死亡。至此，人们开始意识到基因治疗可能具有 潜在的、长期的副作用。因此，大量基因治疗临床试验被搁浅，人们对于基因治疗的期望 也跌入低谷。 6.2基因治疗的不可控 病毒侵入染色体后的位置是随即的，谁也无法保证它不会突然碰触到某些癌基因，所 以说存在治病不成的可能。导入基因治疗的载体一般为病毒载体，存在着安全隐患，如在 病毒载体中可能产生有传染性、野性或辅助性病毒。 6.3用于治疗的基因过少 目前在以用于灵川实验的治疗基因集中于少数基因，对大多数疾病致病基因有待阐明。 ，目前许多未知功能的基因，及其表达调控序列的确定还有待基因组学进一步的发展。 6.4 载体转移基因的效率和靶向性 目前基因治疗没有获得满意的结果，目的基因在涕泪不能持续表达和表达水平不高是 影响治疗的重要因素。载体的特异性识别，如何能保证载体能将外源基因送入到指定的靶 细胞，从而在该细胞中表达，也是癌症研究的一大热点。 6 基因治疗技术前景展望 尽管基因治疗存在诸多问题有待解决，公众和学术界对其也褒贬不一，但我们相信， 作为一种对人类健康影响宽广而深远的新兴的治疗方式，正朝着治愈更大范围疾病的方向 迈进，为很多不治的疾病得患者带来了希望。基因治疗存在巨大潜力已被人们广泛看好， 也始终相信这项技术最终会取得成功，成为人类生物工程史上又一里程碑。 参考文献： 1周东.大肠杆菌基因治疗研究进展J医学综述，2011，17(17)：26102613 2周建光.曾海涛，杨梅金银工程技术的研究及其在临床的应用J医疗装备.20107(23)：27-28 3毛建平.基因治疗 20 年J, 中国生物工程杂志，2010,309):124-129. 4张欣庆；基因治疗的含义、特点及影响J自然杂志，201,25(3):153-318. 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