基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因 表达调控与基因工程表达载体构建的关系。 1原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： （1）结构基因均有调控序列； （2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。 2不同点： 原核生物：（1）RNA 聚合酶只有一种，其 因子决定 RNA 聚合酶识别特异性； （2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占 主导） ；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6） 转录起始是基因表达调控的关键环节。 真核基因表达调控特点：（1）RNA 聚合酶有三种，分别负责三种 RNA 转录，每种 RNA 聚合酶由约 10 个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化； （3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过 程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是 将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点： （1） 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺 失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基 因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 （2） 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的 RNA 聚合酶能够识别插入的基因。 （3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子） ，转录后的 mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体 内不致于受菌体蛋白酶的降解。 二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达 分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主 要环节有什么异同？ 1意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达 调控的机理，明了其利用价值和途径。 2主要环节： （1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载 体上并稳定表达； （2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并 对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要； （3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重 组 DNA； （4）重组子导入受体细胞：通常将重组 DNA 导入大肠杆菌感受态进行扩增和 筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用； （5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有 载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上 述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。 3异同：目的基因功能与表达分析主要是为了研究目的基因的表达情况以期为 基因工程应用打下基础；基因工程则是将目的基因应用于实验对象上以期获得 相应的产物或者实验现象。 根癌农杆菌 Ti 质粒有什么特点？如何构建农杆菌 Ti 表达质粒载体？ 1.Ti 质粒可分为 4 个功能区域：T-DNA 区(transferred-DNA region)：T-DNA 是根癌农杆菌侵染植物细胞时从 Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA；Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活 T-DNA 转移，使根 癌农杆菌表现出毒性；Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码 区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控 Ti 质粒在农杆菌之间 的转移；Ori 区(origin of replication，复制起始区)：Ori 区上的基因调控 Ti 质粒的自我复制。 2. 农杆菌 Ti 表达质粒载体的构建 （1）野生型 Ti 质粒的改造 野生型 Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面： 删除 T-DNA 上的 tms、tmr 和 tmt 基因；加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农 杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；引入植物细胞 的筛选标记基因，便于转基因植物细胞的筛选；引入植物基因的启动子和 polyA 化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆； 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。 （2）中间载体的表达构建 为了使 Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将 T-DNA 片段克隆进 大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌 农杆菌的 Ti 质粒。带有重组 T-DNA 的大肠杆菌衍生载体称为中间载体。 在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，主要包括组成型启动子、 诱导型启动子和组织特异型启动子三类，它们可使外源基因在植物细胞中表达； 当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因时，这些标记基 因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。 （3）植物表达载体的构建 中间表达载体不能将外源基因转化进植物细胞，因此，必须将中间表达载体引 入到上述已改造的受体 Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体 (它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基 因转化中应用。为利用根癌农杆菌的 Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载 体系统。 一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基 因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与 Ti 质粒上 的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到 Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。 T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体 DNA 上。最后利用植物选择标记 基因筛选转化细胞。 双元载体系统是指由两个分别含 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变 Ti 质粒构成的 系统。其中之一是含有 T-DNA 转移所必需的 Vir 区段质粒，它缺失或部分缺 失 T-DNA 序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活 T-DNA 的转移，故称为辅 助 Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有 T-DNA 的质粒，一般作为目的 基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种 寄主范围广泛的 DNA 转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含 有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种 质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内 同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体 的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的 T-DNA 整合进植物 基因组中。 目前以 T-DNA 转化植物细胞的标准方法大多采用 Ti 质粒介导的双元载体系统。 首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌 后，再导入携带辅助 Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。 根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动 Ti 质粒上的 vir 基因，随后 将微型质粒上的 T-DNA 切割下来，转移到植物细胞中。 三、植物病毒表达载体有什么特点？有哪些应用？ 1植物病毒表达载体的特点： （1） 病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因高水平表达； （2） 病毒增殖速度快, 外源基因在很短时间可达最大量的积累； （3） 病毒基因组小，易于进行遗传操作，大多数植物病毒可以通过机械接种 感染植物，适于大规模商业操作； （4） 宿主范围广，一些病毒载体能侵染农杆菌不能或很难转化的单子叶、豆 科和多年生木本植物，扩大了基因工程的宿主范围； （5） 病毒颗粒易于纯化，可显著降低下游生产成本。 2应用：植物病毒作为高效表达载体的用途包括多个方面，如用于病毒病理学 研究、基因表型研究、病毒在植物细胞内转移的研究等，而最有价值的用途是 用于商业生产一些蛋白质或多肽，尤其是利用植物病毒作为表达载体系统生产 疫苗或药用蛋白。这种基因工程植物病毒还有可能作为口服疫苗，与以往的蛋 白或疫苗生产方式有很大的不同，如除了成本较低外，安全性方面也有较大的 优势。 随着载体构建策略的不断完善, 多种病毒将被用于构建不同类型的载体，从而 表达各种不同目的的外源基因，同时更多的医用蛋白或疫苗将在植物中得以表 达，植物将有望成为生产各种不同用途的外源蛋白的大型生物反应器。资料表 明，CPMV 和 TMV 融合抗原表达载体可以大规模生产小分子多肽。杆状单链 正义 RNA 病毒如 TMV、PVX 和 TEV 等可以用来表达较大的蛋白多肽，而且 操作方便，复制表达水平高，表达载体稳定。此外，个别 TMV、PVX 和 PVY 既可以侵染单子叶植物也可以侵染双子叶植物，扩大了寄主范围，适宜不同地 域范围内发展。 四、什么是 RNAi 现象？其分子机制是什么？可能在植物基因工程的 有哪些用途？ 1RNAi 即 RNA 干扰,是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double- stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。 2分子机制：病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主 细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些 dsRNA。宿主细胞对 这些 dsRNA 迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 切割成多 个具有特定长度和结构的小片段 RNA（大约 2123 bp） ，即 siRNA。siRNA 在 细胞内 RNA 解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义 siRNA 再与 体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成 RNA 诱导的沉默复 合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC 与外源性基因表达的 mRNA 的同源区进行特异性结合，RISC 具有核酸酶的功能，在结合部位切割 mRNA，切割位点即是与 siRNA 中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂 mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些 mRNA 的降解反应。siRNA 不仅 能引导 RISC 切割同源单链 mRNA，而且可作为引物与靶 RNA 结合并在 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的 dsRNA，新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割产生大量的次级 siRNA，从而使 RNAi 的作用进一步放大，最终将靶 mRNA 完全降解。 3用途：植物 RNAi 具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利 用 RNAi 技术进行基因功能研究的初步筛选，直接利用 RNAi 创造的特殊性状 变异体进行植物改良，时在植物发育的不同阶段抑制特定基因的表达,对发育生 物学研究也具有重要意义。 五、根据植物基因表达载体构建的几个例子，谈谈基因构建中一般 从哪些方面着手，如何构建，才能获得恰当高效的外源基因表达载 体。 1. 外源基因的表达效率 启动子的强弱。有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关 键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。因此， 选 择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考 虑的问题。 最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地 阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引 起 细胞死亡等问题。当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导 (如温度、药 物等)使阻遏物失活，RNA 聚合酶快速起始转录。 核糖体结合位点的有效性。SD 序列是指原核细胞 mRNA 5端非翻译区同 16S rRNA 3端的互补序列。按统计学的原则，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 个碱基。SD 序列的存在对原核细胞 mRNA 翻译起始至关重要。 SD 序列和起始密码子 AUG 的间距。AUG 是最首选的起始密码子， GUG、UUG 、AUU 和 AUA 有时也用作起始密码子，但非最佳选择。另外， SD 序列与起始密码子之间的距离以 93 为适宜。 密码子组成。尽量避免使用罕用密码子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu) 等。 2. 表达质粒的拷贝数和稳定性 多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比，所以基因扩增为提高外 源基因的表达水平提供了一个方便的方法。对于原核和酵母表达体系而言，选 择 高拷贝数的质粒，以其为基础，组建表达载体。表达载体的稳定性是维持基 因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但同表达载体自身特性有关，也与 受体细胞的 特性密切相关。所以在实际运用时，要充分考虑两方面的因素而确 定好的表达系统。利用选择压力、尽量减少表达载体的大小、通过建立可整合 到染色体中去的载体 等待方式，可以增加表达质粒的稳定性。 3表达产物的稳定性 组建融合基因，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外 源蛋白不被选择性降解。这种通过产生融合蛋白表达外源基因，特别是相对分 子 质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适。 产生可分泌的蛋白。如将外源基因表达产物分泌到大肠杆菌细胞的周质或直 接分泌到培养基。 外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达，这种不溶性的沉淀复合物可 以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。 选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表达产物的降解。 采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质 的稳定性。 4. 工程菌的培养条件 由于细菌在 100L 以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下 200mL 摇瓶 中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模 培养 的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺 方面的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统 或生 物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应 器等。生物学方面的因