tb蛋白芯片检测系统原理

TB 蛋白芯片检测系统原理 大渊蛋白芯片以微孔滤膜为载体，利用微阵列技术将纯化的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）， 基因工程生产并纯化的结核分枝杆菌蛋白 16KDa(rTPA16)和 38KDa(rTPA38)三种抗原固相于 同一膜片上，在加入病人血清标本后利用微孔滤膜的渗滤、浓缩和凝集作用，使抗原抗体反应 在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物直接在膜上显色。显色后的芯片放入芯片识别仪， 在专门软件的支持下对不同点阵的灰度值进行分析。实现了对这三种抗原的抗体进行同步检测， 从而对结核菌的感染情况做出诊断。 TB 蛋白芯片产品特点 （1 ）方法简便快速、操作简单。 （2 ）可进行单人份操作。 （3 ）敏感性高，特异性强。 （4 ）采用芯片识别仪进行结果判定，以数据卡校正系统误差。 （5 ）可以同时检测多项抗体。 （6 ）提供动态的分析资料，供临床医师参考。 临床意义 结核病是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一。据世界卫生组织（WHO）统计，目前全 球人口的 1/3 约 20 亿人曾经感染过结核分枝杆菌，每年出现大约 800 万新病例，约 300 万人死于该病。 发展中国家形势尤为严峻，其中 95%的新发现结核病人出现在发展中国家。我国的结核病疫情相当严重， 患病人数居世界第二位。 脂阿拉伯甘露聚糖（LAM） 脂阿拉伯甘露聚糖是一种非蛋白结核分枝杆菌抗原，属特异性抗原，具有较强的免疫原性， 敏感性 31.7%94%，特异性为 78.6%100%。主要存在于结核菌表面，具有较强的抗原性， 能够刺激结核菌感染者产生抗体。而其它分枝杆菌由于表面 LAM 含量低，不能刺激机体产生 高水平的抗体量，故抗-LAM 的特异性和敏感性都较高，对活动性肺结核，尤其对痰液涂片阴 性及菌阴肺结核的诊断有较好的价值。 38KDa 和 16KDa 蛋白质抗原 38KDa 抗原具有强免疫性。这种抗原在区分结核分枝杆菌感染还是非结核分枝杆菌感染方面具有重 要的实际价值，重组 38KDa 抗原与结核分枝杆菌本身合成的 38KDa 抗原无免疫性差异，其特异性 100%，与正常健康人、非结核分枝杆菌感染和麻风无交叉，敏感性为 69%，高于结核分枝杆菌培养。 38KDa 与 16KDa 联合检测可提高 11.1%的敏感性。结核分枝杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、 种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗原抗体谱。检测时有的抗原不表达， 未检测出相应的抗体；有的抗体含量高，有的则低。因此，多种抗原联合检测，在保证特异性的基础上有 助于提高灵敏度，并可用于结核分枝杆菌的自然感染或卡介苗接种后阳转者的区别。 血样的采集和准备 采取新鲜静脉血或末梢血，分离血清使用，如果实验在采血后 3 天内不能做，应将其在-20保存。 需要做时，应使样本恢复至室温。 适应症 （1 ）用于各级医院对结核菌感染引起的疾病（包括肺结核、肾结核、骨结核、脑结核、皮肤结核等） 的辅助诊断。 （2 ）对疑似结核病患者尤其是排菌阴性者或者其它体征不典型者有较大的提示诊断作用。 （3 ）适用于各级结核病防治机构对大规模人群的结核菌感染血清流行病学调查和感染者的筛查。 检测抗结核分枝杆菌 LAM、16KDa 和 38KDa 抗原之抗体的意义 鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。 提高痰涂片阴性患者的检出率。 肺外结核的检测。 痰涂阴性者的早期诊断。 可作为判断治疗是否有效的指标。 作者：崔晓利，姚小红，刘春梅，张增贤 【摘要】 目的：通过结核菌三种抗原脂阿拉伯 甘露糖(LAM)、16KDa、38KDa 固相于同一膜片上制作的结核蛋白芯片系统联合检测结核 患者血清中的相应抗体，以达到快速诊断结核病的目的。方法：收集西安市结核病胸部肿 瘤医院痰涂片或者结核菌培养阳性患者的血清 98 例，痰涂片或者结核菌培养阴性患者的 血清 54 例，结核性脑炎、结核性胸膜炎患者血清 20 例，通过结核蛋白芯片系统检测三种 抗体，任意一种抗体阳性即为结核抗体阳性。结果：活动性肺结核阳性率 86.7%(85/98)， 痰涂片阴性的肺结核阳性率 66.7%(36/54)，结核性脑炎、结核性胸膜炎阳性率 45%(9/20)。 结论：三种抗原联合使用具有良好的敏感性与特异性，明显优于任何一种抗原单独使用， 联合使用将会对结核病的快速辅助诊断起积极作用。 【关键词】 结核分枝杆菌；联合检测；抗原；芯片 结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾患，特别是我们国家患者数约 450 万，每 年病死近 20 万人。结核病的病原体为结核杆菌，它除了能引起呼吸道感染外，还可引起 其他部位的病变，因此，结核病的早期快速诊断对结核病的防治具有极其重要的意义。我 们使用基因工程表达的结核菌蛋白 16KDa 和 38KDa 以及脂阿拉伯甘露糖 (LAM)三种抗原 制作的结核蛋白芯片联合检测结核抗体，在临床上取得较理想的快速诊断效果。 1 材料与方法 1.1 血清标本来源 结核患者的血清均来源于西安市结核病医院的住院患者，其中痰直涂或者培养阳性患 者 98 例，痰涂片阴性患者 54 例，结核性脑炎或者结核性胸膜炎的患者 20 例。 1.2 结核菌多抗原的 IgG 抗体芯片检测系统 由南京大渊生物技术工程有限责任公司 提供。批准文号：国药准字 S20050089。 1.3 蛋白芯片阅读仪 南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X4。 1.4 芯片系统操作步骤 在芯片上标记样品编号；在芯片盒窗口内滴加 4 滴试剂 A，使膜表面完全浸湿；待完 全渗入后，加入待检血清 100ue；待血清完全渗入后，再滴加 6 滴试剂 B；待试剂 B 完全 渗入后，滴加 10 滴试剂 C；待试剂 C 完全渗入后，最后滴加 6 滴试剂 D；反应完毕后 30 min 内，将芯片放入芯片阅读系统进行分析。阴阳性结果根据南京大渊生物技术工程有限 公司生产的芯片识别仪器设置参数自动判别。 2 结果 三种抗原的抗体联合测定，任何一种阳性即为结核抗体阳性。痰涂片阳性或者培养阳 性的结核患者 98 例，其中结核抗体阳性 85 例，阳性率 86.7%。痰涂片阴性的肺结核患者 54 例，其中 36 例结核抗体阳性，阳性率 66.7%。结核性脑炎、结核性胸膜炎患者 20 例， 其中结核抗体阳性 9 例，阳性率 45%。 3 讨论 检测结核菌抗体用于结核病的诊断一直是结核病基础研究和防治人员追求的目标，而 细胞内病原体引起的感染，机体产生的抗体谱是高度多样性的，从不同患者身上采集的血 清可能引起不同的抗原产生反应，因此对这些病原体引起的传染病诊断可采取用多种抗原 联合检测更多抗体的方法，来提高诊断的灵敏度。结核芯片系统的基本原理是以微孔滤膜 为载体，利用微阵列技术将纯化的结核菌 LAM、蛋白 16KDa 和 38KDa 等三种抗原固相于 同一膜片上并利用微孔滤膜的渗滤浓缩、凝集作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行， 再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色，显色后的芯片放入芯片阅读仪，在专门软件的 支持下，对不同抗原点阵的灰度值进行分析。实现了对这三种抗原的抗体进行同步检测， 从而对结核菌感染情况作出诊断。在结核患者中，抗结核菌单个抗原的抗体阳性率以抗 LAM 的阳性率最高为 54%， LAM 是一种特异的多糖抗原，这种抗原具有较强的抗原性， 能够刺激结核菌感染者产生抗体，而其他分枝杆菌由于表面 LAM 含量低，不能刺激机体 产生高水平的抗体量，故抗LAM 的特异性和敏感性都较高。38KDa 的抗体阳性率次之， 为 45%，这种抗原是其他分支杆菌所不具有的，人感染结核杆菌后会产生针对此 38KDa 蛋白质的特异抗体，最低为 16KDa 的抗体阳性率为 39%，16KDa 是一种特异的蛋白质抗 原，该蛋白质能大大提高实验的灵敏度。每一批结核芯片都有灰度校正光盘，其临界值是 不同的，因此不能混用，否则影响结果的准确性，临界值的确定采用最适工作浓度的抗原 点样，于一定数量的正常对照血清标本反应后，用芯片识别读数仪测定其灰度值，计算均 数及标准差，均数与 2 倍标准差的和即为临界值，各种抗原与标本中的抗体、金标记二抗 反应，得到的灰度值大于或者等于临界值者为阳性，否则为阴性。结核芯片系统联合检测 结核菌抗原的抗体，其敏感性高，检测速度快，患者血清分离出来后，只需要 5 min 就可 以出结果，可以单人操作，大大方便了患者，并且结果的判断采用芯片识别阅读仪，避免 了人为判读的主观误差。芯片反应窗口的膜不能损伤或受潮，在芯片反应过程中，应避免 任何其他物体接触膜表面，以免造成污染，影响结果。标本应为新鲜分离的血清，若是血 浆必须剥离纤维蛋白，以免吸入导致膜孔堵塞，溶血标本和高脂血标本对检测结果有影响