iptg诱导外源基因表达

IPTG 诱导表达原理及操作步骤 E.coli 的乳糖操纵子（元）含 Z、Y 及 A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷 酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列 O、一个启动序列 P 及一个调 节基因 I。I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O 序列结合，使操纵子（元）受阻 遏而处于关闭状态。在启动序列 P 上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白 （CAP）结合位点。由 P 序列、O 序列和 CAP 结合位点共同构成 lac 操纵子的调控 区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没 有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在 PI 启动序列操 纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转 录起动。当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元） 体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经 b半乳糖苷酶催化， 转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致 阻遏蛋白与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极 强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （LuriaBertani）培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液 2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸馏水中，0 . 22 m 滤膜过滤除菌，分装成 1 mL /份， 20 保存。 ( 3 ) l 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 溴酚蓝 10 甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF） 。 （3）10 mg / mL 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / mL DNase I。 2 ）超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 2 ( 2 ) 2SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液： 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 溴酚蓝 20 甘油 实验方案 1、外源基因的诱导表达 (1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体 DNA 和目的基因。 (2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。 (3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒 DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定， 确定无误后进行下一步。 (4）如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则在 30 -32 培养数小时， 使培养液的 OD600 达 0.4-0.6 ，迅速使温度升至 42 继续培养 3 -5h ；如果 表达载体的原核启动子为 tac 等，则 37 培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG 至终浓度为 1 mmol / L。继续培养 3 -5h 。 (5）取上述培养液 1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加 100 L 聚丙烯酰 胺凝胶电泳上样缓冲液后，作 SDS -PAGE 检测。 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 1 ）细菌的裂解 常用方法有： 高温珠磨法； 高压匀浆； 超声破碎法； 酶溶法； 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法 、 已在工业生产中得到 应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法 的 实验步骤。 （1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶； 蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵 母作用显著。主要步骤为： 4 ，5000rpm 离心， 15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（ 100mL） 。弃 上清，约每克湿菌加 3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 目的蛋白的诱导表达和纯化 (1)菌在含氨苄青霉素（100 mg/L）的 LB 培养基中 37 振摇培养过夜 (2)按 10%的接种量转接入新鲜 LB 培养基，250 rpm, 37摇菌至 A600=1 (3)加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L，37继续通气培养 45 h (4)分别于 2h、4h 各取 1.5 mL 菌液，7734g 离心 30s 收集菌体 (5)菌体加入 H2O 60 L，剧烈振荡混匀，再加入 4样品缓冲液 20 L，100， 5 min；7734g 离心 5 min； 3 (6) %SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色后观察诱导结果 (7)大规模培养细菌,诱导表达目的蛋白,离心,收集菌体,将菌体重悬于 lysis buffer,超声破菌 (8)离心后将上清和沉淀分别制样，进行 SDSPAGE (9)可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化. 以 包涵体形式存在的表达产物. 用 N 十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经 缓慢透析去除 N 十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析 柱对目的蛋白进行亲和层析纯化 (10)先以 5 10 个柱体积 (CV) PBS 缓冲液平衡柱, 流速 1.5 ml/min;样品液 10 ml 上样, 流速为 0.5 ml/min, 用 5 10 CV 缓冲液洗脱未结合的物质; 5 CV 的洗脱液洗脱目标蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙烯酰胺凝 胶电泳鉴定表达产物, 检测表达产物的分子量及纯化效果。 重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化 将阳性重组质粒转化至 BL21 中, 选取多个重组菌落接种 LB 液体培养基中 37 振摇培养过夜,按 1100 比例转入新鲜 LB 培养基, 培养至 OD 值为 1.0 时, 加入终浓度为 1.0 mmol/L 的 IPTG 继续诱导培养 3 h。离心, 收集菌体。将诱 导后的菌体重悬于 lysis buffer, 超声破碎后离心去沉淀, 收集样品液。 GSTrapFF 柱亲和层析纯化重组蛋白。 先以 5 10 个柱体积 ( CV) PBS 缓冲液 平衡柱, 流速 1.5 ml/min;样品液 10 ml 上样, 流速为 0.5 ml/min, 用 5 10 CV 缓冲液洗脱未结合的物质; 5 CV 的洗脱液洗脱目标蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE) 鉴定表达产物, 检测表达产物的分子量及纯化效果。 铺板培养 12h 后挑取阳性克隆 ,37、300g 培养至菌液 A260=0.6 时 , 加入终 浓度为 1mmol/L 的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。分别于 2h、4h 各取菌液 100L, 离心收集细菌沉淀 , 行 SDS-PAGE 电泳 , 考马斯亮蓝染色后 观察诱导结果。 大量菌液 37 1mmol/L IPTG 诱导表达 4h 后回收细菌沉淀。将诱导的蛋白用纯 化包涵体的方法进行初步纯化 , 然后进行 SDS-PAGE 电泳 , 回收包涵体.将切下 的目的蛋白条带用电洗脱方法回收。 GST 亲和层析 原理 谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称 GSTs， EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体 的各种组织，是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同功酶，分子量为 23-29KD。 GST 蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，再用还原性谷胱甘肽竞争 GST 上的结合位点将 GST 蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的。1ml 树脂大约可结合 5-8 mg 融 合蛋白，并可反复使用数次。 试剂 IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2g IPTG 溶解入 10ml 水，过滤除菌，分装，-20保 存。Lysis buffer （50ml） 4 1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl 4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water . 操作步骤 1)挑一个克隆至 2ml LB 液中（Amp+ ） 2)37振摇至 OD600 值约为 0.6 3)将 2ml 菌液加入 100 ml LB 中 4)37振摇至 OD600 值约为 0.6 5)加入 IPTG 至终浓度为 1mM 6)继续摇 34h 7)离心（5000 rpm，5min，4） 8)用 10柱体积的 lysis buffer 悬浮细菌 9)超声破碎细胞 10)离心（12,000rpm,15min,4） ，取上清 11)用滤纸过滤 12)加 0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖 beads 于层析柱 13)5柱体积的 lysis buffer 洗层析柱 14)样品过柱 15)5柱体积的 lysis buffer 洗层析柱 16)3柱体积的 elution buffer 洗脱蛋白 17)收集