pcr的相关技术介绍

PCR 的相关技术介绍 一、聚合酶链反应的历史回顾 1、核酸体外扩增最早的设想 由 Khorana 及其同事于 1971 年提出：“经过 DNA 变 性，与合适引物杂交，用 DNA 聚 合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆 tRNA 基 因”。但由于当时很难进行测序和合 成寡核苷酸引物，且当时(1970 年)Smith 等发现了 DNA 限制性内切酶，使体外克隆基因 成为可能，所以，使 Khorana 等的早期设想被人 们遗忘。 2、聚合酶链反应的发明 1985 年，美国 PE-Cetus 公司的人类遗传研究室 Mullis 等人才发明了具有划时代意义 的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核 酸片段的愿望成为现实。其原理类似于 DNA 的体内 复制，只是在试管中给 DNA 的体外 合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow 片段来扩增人基因组 中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性 DNA 后都要重新补加 Klenow 酶 。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热 DNA 聚合酶的应用使得 P CR 反应更易于自动化，继而 PE-Cetus 公司推 出了第一台 PCR 热循环仪，使该技术的 自动化成为现实。Mullis 等因此项技术于 1993 年 获得诺贝尔奖金。 二、聚合酶链反应相关技术的发展 PCR 及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于 1988 年和 1990 年在美国和 英国召开了第一届和第二届 PCR 技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了 PCR 的应用 与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与 PCR 的最新进 展。这 充分体现了生物学家对 PCR 的重视。 名 称 主要用途 简并引物扩增法 扩增未知基因片段 巢居 PCR 提高 PCR 敏感性、特异性，分析突变 复合 PCR 同时检测多个突变或病原 反向 PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变 单一特异引物 PCR 扩增未知基因组 DNA 单侧引物 PCR 通过已知序列扩增未知 cDNA 锚定 PCR 分析具备不同末端的序列 增效 PCR 减少引物二聚体，提高 PCR 特异性 固着 PCR 有利于产物的分离 膜结合 PCR 去除污染的杂质或 PCR 产物残留 表达盒 PCR 产生合成或突变蛋白质的 DNA 片段 连接介导 PCR DNA 甲基化分析、突变和克隆等 RACE-PCR 扩增 cDNA 末端 定量 PCR 定量 mRNA 或染色体基因 原位 PCR 研究表达基因的细胞比例等 臆断 PCR 鉴定细菌或遗传作用 通用引物 PCR 扩增相关基因或检测相关病原 信使扩增表型分型(mapping) 同时分析少量细胞的 mRNA 三、其它扩增技术 与 PCR 及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与 PCR 互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信， 随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。 技术 应用 转录依赖的扩增系统(TAS) 检测 HIV 连接酶链反应(LCR) 检测点突变 自主序列复制(3SR)系统 研究 RNA，临床应用、法医学等 链替代扩增(SDA) 检测、鉴定基因 Q 复制酶系统 增加探针检测敏感性 循环探针反应 增加探针检测敏感性 连接酶链反应 (A) 连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR), 是一种新的 DNA 体外扩增和检测 技术,主 要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是 Backman 1997 年为检出靶基因序列 中的点突 变而设计发明，并申报了专利。 LCR 的基本原理为利用 DNA 连接酶。特异地将双链 DNA 片段连接, 经变性- 退火-连 接 三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。 LCR 的扩增效率与 PCR 相当，用耐热连接酶做 LCR 只用两个温度循环，94 min 变 性 和 65复性并连接，循环 30 次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多 态性 及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。 依赖核酸序列的扩增 (A) 依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA) ，又称自主 序列复制系统(self-sustained sequence replication，3SR)或再生长 序列复制技术。1990 年 Guatelli 等首先报道了这一技术。 NASBA 主要用于 RNA 的扩增、检测及测序。 其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液， 651min 使 RNA 分子二级结构打 开, 降 温至 37加入逆转录酶,T7RNA 聚合酶和 RNase H,并在 37反应 11.5 小时,其 产物 经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。 NASBA 的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控 制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于 PCR，特异性好。 转录依赖的扩增系统 (A) 转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification sytem，TAS)，是 Kwen 等人于 1 989 年研究报道的，主要用于扩增 RNA。 TAS 的主要特点是扩增效率高，因为其 RNA 拷贝数呈 10 的指数方式增加，只需 6 个 循环靶序列的拷贝数就能达到 2106。它的另一个特点是特异性高，由于 TAS 只能进行 6 次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。 虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RN A 多聚酶，有待进一步研究。 Q 复制酶反应 (A) Kacian 等于 1972 年首次报报 Q 复制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 模板的自我 复制 功能，它能在常温 30min，将其天然模板 MDV-1RNA 扩增至 109。1986 年 Chu 等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的 MDV-1RNA 杂交，经洗脱未被结合 的 MDV-1 后，再加入 Q 复制酶，扩增复制 MDV-1 拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。 Q 复制酶是一种 RNA 指导的 RNA 聚合酶，它有 3 个特点：不需寡核苷酸引物的引 导就可启动 RNA 的合成。能特异地识别 RNA 基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的 RNA 折叠结构。在 Q 复制酶的天然模板 MDV-1 RNA 的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。 因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Q 复制酶扩增。 1988 年 Lizardi 等，将靶基因序列插进 MDV-1 质粒里，用 T7RNA 聚合酶催化转录 出 MDV-1 RNA 探针，这种 RNA 探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针 ,加入 Q 复 制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两 种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。 四、PCR 技术的应用举例 研究：基因克隆;DNA 测序;分析突变; 基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结合 DNA 序列; 转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰 ;合成基因的构建 ;构建克隆 或表达载体;检测某基 因的内切酶多态性 诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆 菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS 、EV、C MV、EBV 、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒 B19);寄生虫( 疟疾 等);人遗传病(Lesh- Nyhan 综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等) 免疫学：HLA 分裂;T 细胞受体或抗体多样化的定性; 自身免疫病基因作图;淋巴因子定量 人类基因组工程：用散布重复序列产生 DN