ghr在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义

GHR 在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义 任娟，卫 兵，宋恩学，王文艳， 马玉着 摘 要 目的: 探讨生长激素受体（GHR) 在宫腔粘连（IUA）患者子宫内膜组织中的 表达及意义。方法: 通过免疫组化半定量和实时荧光定量 PCR（QPCR）两种实验方法 分别检测 IUA 组（研究组）和非 IUA 组（对照组）患者子宫内膜组织中 GHR 蛋白和 mRNA 的表达情况。结果：免疫组化实验方法 GHR 蛋白表达：研究组 1.700.57, 对 照组 2.770.75, P =0.00；QPCR 实验方法 GHRmRNA 表达：研究组 0.640.21，对照 组 1.000.33，P=0.03，两组比较差异有统计学意义。免疫组化实验方法:子宫内膜腺体 与子宫内膜间质 GHR 蛋白表达 2=6.053，P=0.025 ，两部位 GHR 蛋白比较差异有统计 学意义。结论：IUA 患者子宫内膜组织中 GHR 的表达低于非 IUA 者，而且这种表达 在子宫内膜腺体中较多，在子宫内膜间质中较少，为 IUA 患者临床使用生长激素提供 一定的理论参考。 【关键词】 宫腔粘连 生长激素受体 生长激素 Expression and significance of Growth hormone receptor in the endometrial tissue of intrauterine adhesion patients Ren Juan, Wei Bing, Song Enxue, et al (Dept of Gynecology and Obstetrics， The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230601) Abstract Objective To investigate the growth hormone receptor (GHR) expression and significance of endometrial tissue in patients with intrauterine adhesions . Methods Semi- quantitative immunohistochemistry and real-time quantitative PCR (QPCR) were used to detect the expression of GHR protein and mRNA IUA in patients endometrial tissue of IUA group (study group) and non IUA group (control group) . Results The immunohistochemical expression of GHR experimental methods: The study group 1.70 0.57, control group 2.77 0.75, P = 0.00; QPCR experimental methods GHRmRNA expression: The study group 0.64 0.21, control group 1.00 0.33, P = 0.03, two group differences were statistically significant. Immunohistochemistry methods: endometrial glands and endometrial stromal GHR protein expression 2 =5.883, P = 0.025, two parts of the GHR protein expression difference was statistically significant. Conclusion The expression of GHR in endometrial tissue in patients with IUA is lower than those of non-IUA, and this expression is more in endometrial glands, less in endometrial stroma ,which provide a theoretical reference for the use of hormone in IUA patients. Key words intrauterine adhesions; growth hormone; growth hormone receptor 宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA) 是因为子宫内膜基底层受损导致肌层裸露,创面 的炎性趋化因子和胶原蛋白渗出沉积 ,再加上宫腔各壁创面紧密接触,在内膜逐渐修复 的过程中形成纤维粘连带，导致宫腔形态和子宫内膜的生理功能难以恢复。临床主要 表现为月经量减少甚至闭经、周期性下腹痛、不孕、反复流产、产后胎盘粘连甚至植 入等。近年来 IUA 患病率也逐年增加, IUA 已严重影响着现代女性的生活质量和生育 要求 1 。IUA 的治疗主要包括经宫腔镜宫腔粘连分解术和术后应用雌激素促子宫内膜 生长。有研究报道，生长激素（Growth hormone，GH）在体外受精-胚胎移植(IVF-ET) 中对反应不良性子宫内膜和子宫内膜反应不良性闭经中都有促进子宫内膜发育的作用 2,3 ,这些研究均提示 GH 可能促进子宫内膜的生长。部分研究者在此基础上试图加用 GH 来提高 IUA 治疗的效果 4 ,但目前关于 GH 研究主要偏于临床，尚缺乏基础研究 的证据。本研究通过免疫组化和实时荧光定量 PCR（Real time quantity-PCR,QPCR）两 种实验方法，研究生长激素受体（Growth hormone receptor,GHR）在 IUA 和非 IUA 患 者子宫内膜组织中的表达情况，为 IUA 患者临床使用生长激素提供一定的理论参考。 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号 81100412） 作者单位：安徽医科大学第二附属医院妇产科,合肥市 230601 作者简介：任 娟，女，硕士研究生； 卫 兵，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，,E- mail:weibing1965 hotmail. com 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1 研究对象 2013 年 11 月至 2014 年 05 月在我院行宫腔镜检查并确诊为 IUA 患者 28 名为研究组，年龄 2035 岁，平均年龄 29. 62 2. 52 岁；同期因其他原因（子宫纵 膈、不孕或节育器嵌顿）行宫腔镜检查确诊为非 IUA 患者 22 例为对照组，年龄 2040 岁，平均年龄 28. 80 3. 34 岁，并且这些非 IUA 患者既往都有宫腔操作史。 1.1.2 主要手术设备 宫腔镜及冷光源（ STORZ 公司 德国）；监视器（ SONY 公司 日本）；液体膨宫泵（ Aesculap 公司 德国）；腹腔镜（STORZ 公司 德国），异物 钳（STORZ 公司 德国）；荧光定量 PCR 仪(Thermo 公司 美国) ；微孔板迷你离心机 (杭州奥盛仪器有限公司) 等等。 1.1.3 主要试剂 免疫组化：一抗： 兔抗人 GHR 单克隆抗体（北京博奥森生物技术有 限公司） ；二抗：即用型快捷免疫组化 MaxVisionTM 试剂盒（鼠/ 兔）（福州迈新生物 技术开发有限公司）；Trizol 和引物（美国 Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（美国 Thermo 公司）; QuantiFast SyBr Green PCR kit（德国 Qiagen 公司）；核酸染料（上海 赛百盛公司）。 1.1.4 术前准备 所有患者空腹状态上午9 时以前抽取静脉血检查生长激素均未见异常， 闭经者手术时间不受限制，月经减少者在卵泡期手术。 1.1.5标本采集 研究组: 患者均行宫腔镜检查确诊为 IUA，在检查中或宫腔镜下宫腔粘 连分离术操作过程中，视需要在尚残存的正常子宫内膜组织中,用异物钳钳取适量（质 量约10mg）的内膜组织作为标本。对照组:患者因其他原因行宫腔镜检查确认为非IUA 且既往有过宫腔操作史,如子宫纵膈、不孕或节育器嵌顿，按需要钳取适量正常子宫内 膜组织。 1.2 检测方法 1.2.1免疫组化MaxVision两步法 ： 取存档蜡块，连续切片4um, 贴片，65温箱烤 片2小时，二甲苯脱蜡；柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复， PBS冲洗3次，每次3分钟； 免疫组化染色按MaxVision 两步法常规流程进行切片中滴加一抗 (兔抗人GHR单克隆 抗体以1：400稀释)，4过夜，PBS 冲洗3次，每次3分钟去除一抗后滴加二抗，试剂盒 37温箱中孵育15分钟， PBS冲洗3次，每次3分钟； 滴加新鲜配制的DAB显色； 清水冲洗，苏木精浅染，清水冲洗还蓝，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶 封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，其余操作流程完全相同。 1.2.2 免疫组化结果判断及半定量分析： 将制好的切片置显微镜下观察，每个样本随机 选取 5 个不重叠 400 倍视野进行测量，阳性信号为棕黄色或棕褐色， 根据阳性信号的 强弱将结果分为弱、 中、 强三级， 并分别给予 13 分： 1 分， 无信号或信号很 弱； 2 分， 信号中等呈淡黄色或棕黄色； 3 分， 信号很强呈棕褐色。根据阳性细 胞的百分率分别给予 13 分： 1 分， 阳性率 20%； 2 分， 阳性率 21% 70% ； 3 分， 阳性率 71% 100%。 上述两项评分相加作为每例的总积分。 表 1 免疫组化染色结果判定标准 合计得分 染色程度 记分 a 着色细胞 百分率 记分 b （a +b)/2 结果判定 基本不着色 1 20% 1 1-2 阴性（-） 淡黄或棕黄 2 20% 70% 2 3-4 阳性（+ ） 棕褐色 3 70% 3 5-6 强阳性（+ ） 1.2.3 QPCR 法 从子宫内膜组织中提取 RNA: 取子宫内膜组织 50-100mg 经液氮研磨 后加入 1ml TRIzol 裂解；加入 0.2mL 氯仿，剧烈震荡； 4 12000rpm 离心 15 分钟，取 上清，加入等体积异丙醇沉降；4 12000rpm 离心 10 分钟，弃上清, 加入 1mL 75乙 醇；4 12000rpm 离心 5 分钟，弃上清， 干燥 RNA 沉淀；加入 20-50 L DEPC 水， 55促溶 10 分钟，-80保存备用。RNA 的浓度及纯度的测定：分别测定 OD 260 和 OD 280 以计算 RNA 样品的浓度和纯度。 样品 cDNA 合成:在 0.2mL 无 RNase PCR 管中，加入总 RNA（质量为 2ug）、10M Oligo（dT）1L、DEPC 水补足至 12L，轻轻混匀、点动离心；PCR 仪上 65加热 5min，立即冰浴 3min；在 0.2mL 无 RNase PCR 管中加入 5Reaction Buffer 4.0L、10mM dNTP Mix 2ul、RibolockTM Rnase inhibitor 1L、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 1L；42 60min，70 5min，取出上述反应液，即为 cDNA，-80 保存备用。荧 光定量 PCR 反应（SYBR GREEN 方法）：取出上述反应液 1ul 作为荧光定量的模板， 反应体系如下：2SYBR Green mixture5uL、Forward primer（10uM ）和 Reverse primer （10uM）各 1uL、cDNA1uL 、RNase Free water2uL，Total 10uL 。 反应条件：95预变性 5min，95 变性 10s、60退火、延伸 30s，共 40 个循环。 表 2 本实验所用人类基因扩增引物 基 因 引物序列 产物长度 人 -actin Forward primer 5-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG -3 Reverse primer 5- CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3 185bp 人 GHR Forward primer 5- CTTTTATGCCCAGGTGAGCGAC -3 Reverse primer 5- GGCAGAGTGAGACCATTTCCG -3 119bp 注：-actin 是此次实验内参。 Forward primer：正向引物；Reverse primer：反向引物。 1.3 统计学处理：采用 SPSS 16.0 统计软件进行分析，数据以 s 表示，免疫组化结x 果计量资料采用 t 检验，计数资料采用 2 检验；QPCR 分析所采用的指标为：2 -Ct。 P005 为差异有统计学意义。 2.结果 2.1 子宫内膜腺体与子宫内膜间质中 GHR 蛋白表达水平比较。免疫组化法检测子宫内 膜腺体和间质中 GHR 蛋白阳性表达结果显示：子宫内膜腺体中阳性细胞率为 62.5%， 子宫内膜间质中阳性细胞率为 35.0%，两部位 GHR 蛋白比较差异有统计学意义 （P=0.025） 。见表 1 与图 1. 表 1 子宫内膜组织中免疫组化染色部位判定结果（%） 阳性细胞染色部位 阴 性（例数） 阳性( 例数) 阳性率 子宫内膜腺体 15 25 62.5% 子宫内膜间质 26 14 35.0% 2 6.053* P 0.025 两部位 GHR 蛋白比较： *P0.05 A B C 图 1 GHR 蛋白在子宫内膜组织中表达 免疫组化染色 MaxVision 两步法400 图 A 是 PBS 阴性对照；图 B 是研究组 GHR 阳性染色定位于细胞质，呈淡黄色（+） ；图 C 是对照组 GHR 阳性染色定位于细胞膜和细胞质中（主要定位在细胞质）呈棕褐色（+） ；图 B 和 图 C 中 GHR 阳性染色都呈弥漫性分布，如风尘状 2.2 子宫内膜组织中 GHR 蛋白表达水平比较。免疫组化方法检测结果显示研究组的 GHR 蛋白表达水平低于对照组（研究组 1.700.57，对照组 2.770.75） ，两组比较差异 有统计学意义（P=0.00） 。见表 2 与图 1. 表 2 研究组与对照组患者子宫内膜组织中 GHR 蛋白表达水平（ s） x 组别 例数 GHR 蛋白 研究组 28 1.700.57* 对照组 22 2.770.75 P 0.00 与对照组比较： *P0.01 2.3 子宫内膜组织中 GHR mRNA 表达水平比较。QPCR 方法检测结果显示研究组的 GHR mRNA 表达水平低于对照组（研究组 0.640.21，对照组 1.000.33） ，两组比较差 异有统计学意义(P =0.03)。见表 3 与图 2； 表 3 研究组与对照组患者子宫内膜组织中 GHR mRNA 表达水平（ s）x 组别 例数 GHR mRNA 研究组 16 0.640.21* 对照组 14 1.000.33 P 0.03 与对照组比较： *P0.05 图 2 QPCR 熔解曲线 A:研究组 -actin 熔解曲线； B:对照组 -actin 熔解曲线； C:研究组 GHR 熔解曲线； D:对照组 GHR 熔解曲线。-actin、GHR 熔解曲线均呈现单一峰，并且解链温度在 80C 左右，说明产物单一， 引物特异性较好，得出的数据可信。 3.讨论 生长激素(GH) 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素, 它 是一种具有广泛生理功能的生长调节素，在女性人体发育时和雌激素一起促进子宫内 膜的生长发育。GH 发挥功能作用主要经由两个途径: 一是诱导肝细胞、肌细胞产生生 长激素介质(Somato-medin, SM) , 再经由 SM 间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生 生理效应 5 。无论那一种方式 GH 都需要首先同细胞表面特异性受体结合，即在生理 激素浓度下 1 分子 GH 与 2 分子 GHR 相结合从而导致受体二聚化 6 ，再由 GHR 介 导将信号传人细胞内促进细胞的有丝分裂，加速细胞的增殖使内膜组织增生 7-8 。成 熟的人 GHR 分子是一个含 620 个氨基酸的单链糖蛋白，其中 N 端 246 个氨基酸含 5 个潜在的糖基化位点，位于细胞外构成激素结合结构域,，C 端 350 个氨基酸位于胞内 构成信号转导结构域 9 。 正常情况下子宫内膜在雌孕激素作用下有很强的再生能力，只要内膜基底层不受 损伤，或者部分基底层受损，没有完全形成粗糙面，则受损部位的内膜能够很快再生 而修复。IUA 主要是由于子宫内膜基底层严重受损，无法再生修复，宫腔部分或全部 闭塞，约 90%由过度刮宫引起。我们的实验结果表明，研究组和对照组都有过宫腔操 作史，同样是子宫内膜受损的条件下，研究组子宫内膜腺体中的 GHR 表达程度明显低 于对照组，并且这种表达在子宫内膜腺体中的表达较多，而在子宫内膜间质中的表达 较少。这表明 GH 有可能是通过促进子宫内膜腺体的增生和发育以增强子宫内膜的厚 度和容受性，从而为 IUA 患者术后加用生长激素提供了理论依据，也为临床应用生长 激素治疗 IVF-ET 中对反应不良性子宫内膜和子宫内膜反应不良性闭经提供了实验证据。 但是如果子宫内膜腺体中 GHR 不足、缺乏或变异，单方面提高 GH 水平并不能提高子 宫内膜的厚度及容受性，相反超生理剂量的 GH 对 GHR 有反向调节作用 10 ，过量的 GH 将会阻止了受体二聚化和信息传递甚至可能会增加患子宫内膜癌的风险 11 。GH 有增强子宫内膜的厚度和容受性的作用，但是在临床中其使用的剂量尚缺乏统一的标 准，因此临床使用 GH 治疗 IUA 时，要充分考虑到 GHR 的数量，选择合适的个体化 治疗方案。 大量的临床资料已证实 IUA 是由于创伤或感染等因素而导致的子宫内膜基底层受损 后的修复异常所致 12 。同样在子宫内膜受损和血液中 GH 水平正常的条件下，我们 的研究表明 GHR 在 IUA 患者子宫内膜组织中的表达水平低于非 IUA 者，这可能是由 于宫腔黏连患者子宫内膜组织中的 GHR 水平较低导致受损的子宫内膜难以修复或异常 修复，可能是宫腔黏连形成的重要原因之一，是不是患者子宫内膜组织中的 GHR 水平 越低宫腔黏连的程度就越严重，需要扩大样本量进一步研究。 参考文献 1杨峥莉，刘荣霞，郝国荣. PDGF、TGF- 在 IUA 患者子宫内膜中的表达J . 河北医药，2013，35（16) : 2460 -61 2 Farrar MA Design and use of constitutively active stat5 constructsJ Methods Enzymol，2010，485: 583-96. 3Achache H，Tsafrir A Defective endometrial prostaglandin synthesis identified in patients with repeated implantation failure undergoing in vitro fertilizationJ Fertil Steril，2010，94 ( 4 ) :1271-78. 4胡银逢，卫兵，宋恩学 生长激素预防 IUA 分离术后再粘连的作用 J 安 徽医科大学学报，2013， 48（11) : 1405 -06 5燕方龙， 李洪森， 王金龙等. 重组人生长激素稳定性研究进展J . 上海医药 2010， 31 ( 9) : 414-16. 6李苏宜. 重组人生长激素干预 GHR 不同表达水平人肝癌细胞的实验研究D. 郑州：郑州大学，2010：47. 7Carrosco M，Gonzalez O，Perez LG,et a1Diabetic ketoacidosis as the first manifestation of a mixed growth hormone and prolac