4植物基因克隆的策略与方法

植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它 DNA顺序插 入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获 得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确 其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生 理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优 良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术 已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质 及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因 作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植 物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取 得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和 已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应 的编码蛋白后构建 cDNA文库或基因组文库,DNA 文库中基因的筛选 根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测 序,据此合成寡核苷酸探针从 cDNA库或基因组文库中筛选编码基因, (2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从 cDNA入载体表达库中筛 选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离 利用这种策略。 Hain 等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成 酶基因(Vst1 和 Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高 对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中 无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生 对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain 等,1985)。Kondo 等 1989年对 编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组 DNA做了克隆和序列分析 (Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻 cDNA文库,分离了编码水稻 巯基蛋白酶抑制剂的 cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是 一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分 离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并 克隆了编码该病毒外壳蛋白的 cDNA基因(胡天华等,1989)。王春香 等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯 x病毒(potato virus X, pvx),克隆了完整的马铃薯 x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因 转入马铃薯中,以期获得抗 pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。 病毒外壳蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆,可使转基因植物 中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒 CP-RNA介导的抗性。Van kan 报道从真菌 中成功的克隆出无毒基因 Avr9,可直接利用此基因介导广谱高效的 基因工程植物(Van Kan 等,1991)。我们 1995年构建了天麻 cDNA文 库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的 cDNA克 隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等, 1995;舒群芳等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质 来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生 化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白 质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。只要有 一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的。采 用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产 物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。 随着分子生物学技术的发展,一条新的基因克隆策略逐渐形成,这就 是定位克隆。 2 定位克隆(Positional cloning) 根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体 位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗 性的生化机制,这样一种策略叫定位克隆(Monaco,1994)。连锁分析 即通过基因与 DNA标记之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若 某种性状的基因与 DNA标记在子代不分离,即有连锁在一起的趋势。 根据这一原理可将与已知的某一 DNA标记连锁的基因在染色体上定 位。由于连锁分析需要依赖特定的基因作为连锁标记,即标记基因与 待研基因之间存在连锁关系,而满足与待研基因相连锁的基因实在太 少,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLP 的出 现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克 服的困难。 1980 年 Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性 RFLP (restriction fragment length polymorphism),使对任何一 种表型相关的基因的定位成为可能。限制酶切片段长度多态性是用 限制性内切酶切割后产生的 DNA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传, 是存在于全基因组的独特的多态标记,RFLP 使基因定位变得易行 (Wyman等,1980)。目前定位克隆一般是用 RFLP等分子标记制作遗 传图谱,寻找与待测基因连锁的 RFLP标记,获得基因在染色体上的定 位然后克隆基因。所以 RFLP和后来发展起来的 RAPD技术的建立,可 将待测基因相对准确地定位,利用已知的基因可分离与之连锁的未知 基因。其基本程序是构建一个基因组文库、用已知的 A基因为探针, 从基因组文库中筛选出与其有同源序列的 a克隆,再用 a克隆为探针 从基因组文库中筛选出与 a克隆有同源序列的 b克隆,然后以此类推 最后筛选出未知基因并把它分离出来。目前已在番茄、烟草、大麦、 水稻、大豆、玉米等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的 RFLP标记 并构建了遗传图谱(Figdore 等,1988;Heun 等, 1991;Smith,1991;Diers等,1992)。用这种方法已分别克隆到拟南 芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因(Martin 等,1993;Bent 等,1994;Mindrinos 等,1994;Wenyuan 等,1995) 。Martin 等 1993 年最早用定位克隆技术克隆出番茄 pto基因,pto 基因负责对带有无 毒基因 Avrpto的细菌,丁香假单胞菌(pseudomonas syringae pv)菌 株的抗性,Pto 基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗 性(Martin 等,1993)。Wenyuan 等 1995年用这一技术克隆了水稻 Xa21基因,Xa21 基因对真菌 Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) 具有抗性(Wenyuan 等,1995)。 3 转座子标记法(transposon tagging) 转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的 DNA片段。在转 座过程中原来位置的 DNA片段(转座子)并未消失,发生转移的只是转 座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活 并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。通过转座子 上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突 变基因来。转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转 座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因(Fedoroff 等,1984;Jones 等,1994)。 利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:(1) 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。(2) 把转座子导入目标植物。(3) 利用 Southern杂交等技术检测转座子 是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中,这是转座子定位和分离 目标基因所不可缺少的。(4) 转座子插入突变的鉴定及其分离 (Ellis等,1992)。通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的 Ac. Mu, Smp和 Ds等。Ac 含有编码转座酶的基因,能够自主的转座,Ds 不含 转座酶所以不能自主的转座,但 Ds-Ac系统因 Ac为 Ds提供了转座酶 就可以自主的转座了。用转座子标记法进行植物基因的分离,首要的 是把 Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中,目前多数是利用 土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中(Keller 等, 1993;Bancroft等,1993)。目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植 物中克隆出抗性基因(Johal 和 Briggs,1992;Whitham等, 1994;Jones等,1994;Gregory 等,1995)。Johal 和 Brigge分离出抗 灰色长蠕孢(Helminth osporium carbonum)1 号小种玉米的 HMI特 异真菌抗性基因。该基因存在于玉米的抗性品种中,能够分解长蠕孢 1号小种产生的对玉米具特异致病性的 HC毒素,该基因编码 HC毒素 脱毒酶可使植物具有抗病性(Johal 和 Briggs,1992)。和转座子标记 法的原理相似的还有 T-DNA标记法,两者都是由于一段基因的插入导 致染色体结构发生变化产生突变体,而 T-DNA标记法产生的突变是由 于 T-DNA插入导致的。Kenneth 等利用 T-DNA插入标记培育出拟南 芥矮化突变体(Kenneth 等,1989)。 4 人工合成并克隆基因 蜘蛛毒素是一种小肽,它只有 37个氨基酸,体外实验表明它能杀 死多种对农作物有害的昆虫,蒋红等 1995年根据蜘蛛毒素的氨基酸 序列,采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆了此肽的基因(蒋红等, 1995)。Adang 1995 年人工合成了苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基因(Adang 等, 1995)。 5 表型克隆(phenotype cloning) 1995 年 Jonsson和 Weissman提出表型克隆概念(Jonsson 和 Weissman,1995),有些植物目前即不了解它的基因产物,也没有对它 们进行基因定位,但已知植物在表型上存在差异,利用表型差异或组 织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。San 等 用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因(Sun 等,1992)。表 型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来, 从而分离特定表型相关基因,力求不必事先知道基因的生化功能或图 谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因(Brown,1994)。 6 mRNA 差异显示(mRNA differential display) 1993 年 Liang和 Averboukh等科学家提出了 mRNA差异显示 (mRNA DD, mRNA differential display)的方案(Liang 等,1993)。 这一方案的依据是在高等真核生物中所有的生命过程和病理变化,不 论是由单基因控制的还是由多基因控制的,最终都是通过基因表达的 质或量的差异而体现出来。研究基因表达差异,研究两基因组差异表 达基因的分离,为克隆复杂性状相关基因开辟了重要的途径。该方案 可以检测、分离出全长任何部分有突变的 mRNA,其基本程序是:(1) 提取两种细胞的 mRNA,反转录后成为 2种 cDNA。(2) 以一定的引物 作随机聚合酶链反应。(3) 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样 品间的差异条带。(4)将差异 DNA做成探针。(5) 在 cDNA文库或基 因组文库中筛选基因并作功能分析(Baeur 等,1993)。Liang 和 Pardee又建立了 mRNA差别显示 PCR方法(Liang 和 Pardee,1992), 该方法可以同时分析几个样品间基因的表达,检测灵敏度高,PCR 扩 增后,一些表达量很低的 mRNA也能被检测出来,应用 PCR及 DNA测序， 两种技术简单易行,目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因 (Joshi等,1996)和水稻蔗糖调节基因(Tseng 等,1995)等。 7 减法杂交(Subtractive hybridization) Lee 等 1991年提出减法杂交技术(Lee 等,1991),植物在生长发 育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段,由于基因特异性的表 达,其 mRNA表现不同,这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA,反转 录为 cDNA,从无特异基因表达的组织中提取 mRNA,两者杂交,在表达 特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成 杂交分子,而特异 mRNA转录的 cDNA仍保持单链状态,把这种单链 cDNA分离出来即为差异表达的基因,Chong 等用此技术克隆了小麦春 化相关基因(Chong 等,1994)。 8 PCR 扩增克隆 这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已经知道 了很多植物基因的序列,当克隆类似基因时可先从 Gene bank库中找 到有关基因序列,用 PCR方法克隆不同植物的基因。基本方法是根据 已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取 DNA进行 PCR扩 增,扩增的片段纯化后连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析 检测重组子,并与已知基因序列进行比较,如目前已在玉米、水稻、 向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨